恙虫病东方体Karp株融合抗原的莴苣叶绿体生物封装表达、胶囊化及免疫效应评价

Vaccine is the best way for prevention and control tsutsugamushi disease (TD). New more effective and safe TD vaccines are urgently needed to manufacture since there is no ideal vaccines for using all over the world. The strategy based on fusion antigen proteins outside membrane of orientia tsutsugamushi(Ot) for developing novel subunit vaccines could promote efficient protection. The 56kD, 47kD and 22kD proteins encode by Sta56, Sta47 and Sta22 genes of Ot can be used as the desirable target antigens for TD vaccine research. Transgenic plants as bioreactors provide a new way for medical production of oral vaccine. We will clone Sta56, Sta47 and Sta22 gene segments of Ot strain Karp encoded major antigenic epitopes and obtain Sta56-Sta47-Sta22-CTB fusion antigen gene in this research, then express them in lettuce chloroplasts by means of bioencapsulation and nuclear genetic expression mode mediated by plant vector,gain genetic stability transgenic lettuce strains, specific fusion antigen proteins and capsules from lyophilized lettuce leaves, evaluate immunogenicity of all kinds of antigen materies after identification, protection and treatment effects, elucidate animal immune response mechanism of various antigens.This research will provide new materials and theoretical foundation for study and development new TD vaccines.

疫苗是预防和控制恙虫病的最佳途径，目前尚无理想的恙虫病疫苗可供使用，急需研制新型有效的恙虫病疫苗。基于恙虫病东方体外膜蛋白的融合亚单位疫苗是目前研究的主要方向之一，东方体Sta56、Sta47、Sta22基因编码的蛋白可作为研发恙虫病疫苗的理想靶抗原。转基因植物作为生物反应器生产口服疫苗为医用疫苗的生产提供了新途径。本项目在克隆恙虫病东方体Karp株Sta56、Sta47和Sta22基因主要抗原表位编码片段的基础上，获得Sta56-Sta47-Sta22-CTB融合编码基因；通过植物载体介导其在叶用莴苣叶绿体中进行生物封装表达，获得稳定遗传的转基因莴苣株系、特异融合抗原蛋白以及叶片组织冻干胶囊并鉴定；观察评价所得到的纯化抗原蛋白、转基因莴苣叶片胶囊的小鼠免疫原性及保护、治疗效果，阐明各种抗原物质的动物免疫应答机制。本项目研究将为研制和开发新型的恙虫病疫苗提供新思路、新材料并奠定其理论基础。

恙虫病是由恙虫病东方体引起的急性自然疫源传染病，其致病性强，早期临床诊断困难，严重威胁人类的生命健康。目前有疫区扩大、疫情回升的趋势，耐药株的出现也使恙虫病复发率提高、抗生素治疗效果下降，其预防控制是我国传染病预防控制的重要课题之一。由于对恙虫病东方体的抗原性、免疫原性、株型及血清型等研究仍不够深入，其疫苗研制尚处于传统疫苗研究阶段，且一直未能获得满意结果，研制新型有效的恙虫病疫苗势在必行。外膜蛋白是近年来研制恙虫病疫苗的最常用靶抗原。转基因植物作为生物反应器生产口服疫苗为医用疫苗的研发提供了新途径。本项目采用分子生物学、植物转基因等技术，首先以恙虫病东方体Karp株基因组为模板，克隆了Sta56、Sta47和Sta22基因及各自的主要编码抗原表位片段。在此基础上，采用融合PCR技术，获得了Sta47-Sta22、Sta56-Sta22、Sta47-Sta56、Sta47-Sta56-Sta22融合抗原编码基因。然后，将上述基因片段成功构建到克隆载体、原核表达及植物载体上。原核表达及优化表达工作中发现Sta47、Sta56及其主要抗原表位编码片段表达成功，但Sta22基因及携带Sta22基因的融合基因均不表达。将植物表达载体转化莴苣，遗传及表达外源蛋白的鉴定和检测发现，原代培养中含Sta22基因及融合基因载体转化率较低，且大部分不能传代，蛋白表达量低。另外，我们通过生物信息学方法，分析了并获得了Sta56、Sta47、Sta22、Sta58基因及编码蛋白的免疫特性及抗原表位分布情况。进行了转基因植物叶片冻干胶囊的制备工作，尝试建立恙虫病东方体体外培养平台，还进行了基于电化学DNA传感技术快速诊断恙虫病、肺炎支原体方法的前期基础研究。本研究可为研制与开发新型的恙虫病疫苗奠定理论基础及提供新材料，对我国强化恙虫病防治起到积极的推动作用。