基于超支化DNA靶向聚合的无酶化核酸检测研究

Aiming to resolve the current challenges of the diagnostics in developing countries and districts, we propose an enzyme-free nucleic acid diagnosis strategy which is based on the target triggered polymerization of hyper-branched DNA (HB-DNA). With the enzyme-free diagnostics, we develop a promising point-of-care (POC) technology to detect the epidemic diseases such as HIV and TB. Our proposal focuses on three major objectives: 1) set up the system of molecular design, synthesis, characterization and evaluation of HB-DNA, showing the capability of the precise control of DNA molecules; 2) set up the system of the target polymerization of HB-DNA which is triggered by pathogen biomarkers, to realize simultaneous recognition and amplification of biomarkers; 3) integrate the enzyme-free nucleic acid diagnosis system on microfluidic chips. The critical innovation and key technology lies in the enzyme-free recognition and amplification of the pathogen biomarkers through the precise molecular control of HB-DNA. We believe our proposal provides theory basis and key technologies for the POC diagnostics in developing countries and districts; and we envision that our system can be further extended to home diagnostics.

针对发展中国家和地区疾病检测诊断面临的难题,申请者提出了基于超支化DNA（HB-DNA）靶向聚合的无酶化核酸检测方法，以应用于重大流行疾病(如艾滋病和肺结核)的现场检测（POC）。主要研究内容包括：1）建立HB-DNA设计、合成、表征、评价系统，实现HB-DNA的精准分子操控；2）建立病原体标志物触发HB-DNA靶向聚合系统，实现病原体标志物的无酶化识别和信号放大；3）无酶化核酸检测系统的微流芯片集成。本项目的主要创新点和关键技术在于通过HB-DNA的精准分子操纵实现疾病检测的无酶化识别与放大，有效克服当前POC检测面临的需要生化酶的主要问题。本研究可望为发展中国家和地区的POC疾病检测诊断提供基础理论和关键技术，为POC检测设备的产业化奠定基础；更进一步，还可以推广至更为广泛的家庭自助式疾病检测领域。

受本基金项目资助，项目负责人仰大勇以通讯作者发表论文26篇（基金标注），包括J. Am. Chem. Soc. 2篇、Angew. Chem. 1篇、Nano Lett. 1篇、Prog. Polym. Sci. 2篇、Adv. Sci. 1篇、Biomaterials 1篇、Small 2篇等；申请发明专利43项，其中授权5项。受本基金项目资助，培养毕业硕士9名；在读博士9名，在读硕士29名；引进博士后2名，预聘教师3名。所指导的研究生获得国家奖学金3人次，所指导的博士后和课题组内青年教师获得中国博士后科学基金面上项目3项、国家自然科学基金3项、天津市自然科学基金2项。.针对当前疾病诊断检测方法大多需要使用生化酶从而不适合现场诊断（point-of-care，POC）检测的现实问题，本项目研究和建立了一种全新的无酶化核酸检测系统，以用于发展中国家和地区流行重大疾病的POC检测诊断。本项目在执行期间根据计划顺利推进相关研究，完成了项目的预期目标。取得的原创性成果主要有：1）建立了一套HB-DNA分子设计、合成、组装、靶向聚合系统，对病原体标志物进行识别和信号放大。设计并合成组装了HB-DNA；建立了基于枝状DNA纳米结构的靶标触发聚合体系（target-triggered polymerization，TTP）；验证了HB-DNA在靶标DNA触发下聚合成纳米结构。2）满足疾病检测要求，评估体系的检测限。检测了两种HB-DNA单体在特异性靶标序列的触发下快速聚合，实现快速、无酶化的碱基突变检测；验证了本体系无需酶的参与，仅在靶标序列的存在下发生，具有极好的特异性；评估了本体系可达到500 fM级别的灵敏度。3）为了适合于发展中国家和地区POC检测，评估检测在各种不同环境中的稳健性。验证了TTP体系在一系列复杂环境中表现出很好的稳健性，适用于不同水质、模拟体液和血清环境，为未来的实际应用奠定了良好的基础。4）为将来研发便携的POC检测产品奠定技术基础，将检测系统集成在芯片上。有效区分不同数目的碱基突变（1-4个），以及单碱基突变的不同位置。项目执行期间的阶段性进展和研究成果以宣传稿或科普文章形式被人民日报、新华网、科技日报、经济日报、中国科学院和自然科学基金委等媒体或官方网站报道。