核酸蛋白探针双识别生物传感检测DNA甲基化的研究

DNA甲基化所致的抑癌基因沉默是肿瘤发生的关键因素。甲基化异常在早期癌,甚至癌前病变即已出现。抑癌基因甲基化检测，有助于肿瘤早期诊断。传统的甲基化检测方法操作繁琐，稳定性差。本研究拟建技术方案摈弃传统的以亚硫酸氢盐化学修饰和酶切为基础的DNA甲基化检测思路，设想以生物传感器为检测平台，建立基于核酸探针和甲基化CpG结合蛋白双识别的DNA甲基化检测技术。首先以表面等离子共振（SPR）生物传感器芯片表面包被的特异性核酸探针识别待测基因启动子区核酸序列，继而以甲基化CpG结合蛋白识别其中含甲基化的部分，经胶体金修饰的结合蛋白可使SPR信号放大；对于甲基化阳性的样本，芯片表面形成核酸探针－甲基化核酸片段－甲基化CpG结合蛋白"三明治"样复合物；最终分析SPR角的变化，进行甲基化目的基因的检测。本技术简便、快捷、灵敏，特异，有望为早期发现肿瘤提供有效的检测方法，并开拓甲基化检测研究新的技术领域。

抑癌基因甲基化与肿瘤的发生密切相关，被认为是一种新型的肿瘤标志物。然而，传统的甲基化检测技术繁琐费力，难以应用于临床。本研究利用甲基化CpG结合域(methyl-CpG-binding domain，MBD)特异结合甲基化DNA的特性，借助表面等离子共振（surface plasmon resonance ,SPR）生物传感器平台，建立了一种新型核酸蛋白双探针生物传感DNA甲基化检测技术。本研究首先对人甲基化CpG结合蛋白2（methyl-CpG-binding protein 2，Mecp2）的MBD区行密码子优化，将人工合成的DNA克隆至原核表达载体pGS21a，在大肠杆菌E. coli Rosetta（DE3）中表达，并纯化获得重组MBD蛋白。在成功表达MBD蛋白的基础上，本研究以检测抑癌基因APC和RASSF1A为模型，建立了核酸蛋白双探针生物传感DNA甲基化检测方法。根据抑癌基因APC和RASSF1A启动子的核酸序列，设计并人工合成核酸探针，通过生物素--亲和素系统，固化在SPR芯片表面。提取待测样品的DNA，热变性后上样于SPR芯片; 待核酸杂交完成后, 将重组MBD蛋白进样，由于MBD特异结合甲基化DNA的特性，MBD与芯片表面被探针所捕捉的甲基化DNA相结合，引发SPR角的偏移。根据SPR生物传感器实时监测的SPR角的变化数据，判断待测样品的APC和RASSF1A基因启动子区是否为甲基化状态。本研究所建的核酸蛋白双探针生物传感DNA甲基化检测方法能检出5 pmoL的甲基化DNA，整个检测仅需1h, 较传统方法至少节约2天的检测时间。本技术方案较传统的基于化学修饰和甲基化敏感性限制性内切酶的技术简便快捷，更加灵敏特异，有较好的临床应用前景，可能用于肿瘤的早期诊断、疗效监测和预后评估。