甲状旁腺素相关肽核定位序列和C末端在血管再狭窄中的作用及机制研究

为了研究PTHrP核定位序列（NLS）和C末端在血管再狭窄中的作用及分子机制，拟利用PTHrP KI小鼠模型，使用病理组织学和细胞分子生物学方法，观察PTHrP NLS和C末端缺失后对血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移、增殖和凋亡的影响；利用基因重组方法制备PTHrP87-139蛋白处理PTHrP KI小鼠来源的VSMCs，从细胞和分子水平上观察PTHrP87-139能否矫正PTHrP KI引起的VSMCs迁移、增殖和凋亡的异常；建立小鼠股动脉损伤模型，利用基因重组PTHrP87-139蛋白干预，从整体水平上分析PTHrP87-139在血管再狭窄中的作用。利用P27-/-小鼠和PTHrP KI小鼠建立P27和PTHrP KI双基因突变小鼠，分别从体外和体内证明P27是PTHrP NLS和C末端的下游靶标参与调节VSMCs增殖、迁移、凋亡和在血管再狭窄的作用。为临床血管再狭窄防治提供了新靶标。

再狭窄是血管损伤后一种新内膜增生和血管重塑损伤反应过程，血管平滑肌细胞起着至关重要的作用。因此，调控血管平滑肌细胞增殖、凋亡，迁移的生物行为的信号通路研究对于再狭窄的预防是非常重要的。在心血管系统，PTHrP在血管平滑肌细胞中广泛表达，调节血管平滑肌细胞增殖和收缩。PTHrP包括成熟的N-末端，C-末端区和中间，各有独特的生理功能。我们通过在小鼠PTHrP基因第84位氨基酸序列后敲入(Knock-In)一氨基酸翻译的终止子——TGA，使其只表达PTHrP(1-84)，而不表达NLS和C-末端，这样就产生了PTHrP NLS和C-末端敲除小鼠(即PTHrP KI小鼠)。为探讨PTHrP NLS机制和C端片段在血管再狭窄过程的影响，我们培养了主动脉来源的平滑肌细胞并研究细胞迁移，增殖和凋亡功能。结果发现，与野生型小鼠来源的VSMC相比，KI小鼠VSMC高表达P16，P19，P27和P53蛋白；细胞迁移和增殖能力增强而凋亡程度相近。利用基因重组方法制备PTHrP87-139 蛋白处理PTHrP KI 小鼠来源的VSMCs后，我们发现87-139蛋白能够增强细胞迁移、增殖能力，抑制细胞凋亡。在骨髓干细胞和脾脏、胸腺、皮肤等器官中，我们同样证实PTHrP 87-139蛋白具有减少细胞凋亡，促进细胞增殖和抗细胞衰老作用。P27 和PTHrP KI双基因突变小鼠生存寿命较PTHrP KI小鼠生存期虽有所延长，但仅能维持在4周左右,且体型虽较KI小鼠有所改变，但与WT小鼠相比仍明显偏小。利用P27-/-和KI+/-杂合子小鼠来进行相关研究，结果发现部分敲除KI能部分纠正P27基因敲除后血管损伤后再狭窄程度，说明PTHrP NLS和C-末端片段发挥调节VSMC的作用和P27密切相关。