谷氨酸棒杆菌高产L-瓜氨酸的分子机制及系统代谢工程改造研究

L-citrulline is a natural non-proteinogenic amino acid, has a wide range of physiological functions, and can be widely used in food and health industries. In recent years, L-citrulline production by microbial fermentation is gaining more and more attention. Corynebacterium glutamicum has a great potential to become L-citrulline high producing strain, but now the production of L-citrulline by C. glutamicum is very low. In this project, the metabolic regulation mechanism of L-citrulline biosynthesis in C. glutamicum was studied to investigate the possible feedback inhibition and feedback repression in L-citrulline biosynthetic pathway. On this basis, systems metabolic engineering of C. glutamicum for L-citrulline high production was performed, including optimization of L-citrulline biosynthetic pathway, optimization of central metabolic pathways, balance of auxiliary precursor supply, enhancing of cofactor and energy supplies, enhancing of transport pathway and attenuation of byproducts pathway. This project can lay the foundation for the industrial L-citrulline production by microbial fermentation, and provide references for the metabolic engineering of amino acid producing strains.

L-瓜氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸具有多种生理功能，应用前景非常广阔。微生物发酵法生产L-瓜氨酸近年来逐渐得到重视。谷氨酸棒杆菌具有很大潜力成为L-瓜氨酸高产菌株，但是目前利用谷氨酸棒杆菌发酵生产L-瓜氨酸产量很低。本项目对谷氨酸棒杆菌L-瓜氨酸合成的代谢调节机制进行研究，分析L-瓜氨酸合成过程中可能存在的反馈抑制与反馈阻遏作用。在此基础上，对谷氨酸棒杆菌进行系统代谢工程改造以获得L-瓜氨酸高产菌株，主要包括：L-瓜氨酸主合成途径优化、中心代谢途径优化、辅前体供应平衡、增强辅因子与能量供应、增强转运途径以及弱化副产物途径。为工业化微生物发酵生产L-瓜氨酸奠定基础，同时也为产氨基酸菌株代谢工程育种相关研究提供参考。

本项目对谷氨酸棒杆菌L-瓜氨酸合成代谢调控机制及高产L-瓜氨酸菌株构建进行了研究。谷氨酸棒杆菌中L-瓜氨酸与L-精氨酸由同一条代谢途径合成。首先，与其他课题组合作利用转录组学解析谷氨酸棒杆菌高产L-精氨酸机制，并获取L-瓜氨酸与L-精氨酸合成途径、中心代谢途径、副产物合成途径和氨转运途径等代谢调控位点。然后，对L-瓜氨酸主合成途径编码基因操纵子进行优化，失活阻遏蛋白ArgR和精氨琥珀酸合酶并表达大肠杆菌来源的N-乙酰谷氨酸激酶，增强L-瓜氨酸合成代谢途径并阻断了L-瓜氨酸向L-精氨酸的转化，获得的菌株CRBG摇瓶发酵可积累5.7 g/L的L-瓜氨酸。对TCA循环进行调控，利用延伸因子Tu启动子Ptuf增强异柠檬酸脱氢酶表达水平，利用核糖体结合位点替换降低α-酮戊二酸脱氢酶复合体E1o亚基的表达量，促进碳代谢流进入L-瓜氨酸合成途径。对副产物合成途径进行调控，利用核糖体结合位点替换降低天冬氨酸激酶的表达量，降低副产物合成对碳代谢流、辅因子和能量的消耗。利用启动子Ptuf增强氨透性酶表达水平，促进氨转运，为L-瓜氨酸合成增强氨供给。最终菌株CCIT摇瓶发酵可积累9.6 g/L的L-瓜氨酸，发酵罐补料分批发酵L-瓜氨酸产量为28.2 g/L。本项目研究能够为微生物发酵生产L-瓜氨酸，同时也为产氨基酸菌株代谢工程育种相关研究提供有益借鉴。