基于辅酶代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸机制研究

L-Arginine, an important amino acid, plays a key role in pharmaceutical and food industry.Cofactor engineering is an important strategy for enhancing arginine yield and productivity. In this work, we attempt to improve production of L-arginine by engineering cofactor in Corynebacterium glutamicum. The main strategies are as follows: (1) Overexpress pntAB encoding transhydrogenase and ppnK encoding NAD kinase to increase NADPH concentration for improving L-arginine production; (2) Convert the cofactor specificity of NAD+ dependent oxidoreductases to NADP+ dependent in EMP and TCA pathway for improving NADPH concentration; (3) Convert the cofactor specificity of NADPH dependent oxidoreductases to NADH dependent in α-ketoglutarate to L-arginine pathway for reducing demand of NADPH and improving L-arginine production. Optimize the engineering strategy through the verification of enzyme characteristics and determination of intracellular coenzyme content. This idea may provide a guiding significance for the study of cofactor regeneration mechanism and other amino acids production.

L-精氨酸是一种重要的氨基酸，在医药和食品行业中有广泛应用，辅酶工程改造是提高精氨酸产量和产率的一种重要策略。本课题以诱变筛选得到的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，拟通过基因工程改造代谢途径和定向进化改造辅酶特异性，以提高精氨酸的产量、产率和生产强度。具体有三种策略：（1）在谷氨酸棒杆菌中表达E. coli 中尿嘧啶转氢酶基因pntAB，过表达NAD激酶基因ppnK，提高胞内NADPH含量；（2）利用蛋白质工程技术改造EMP途径或TCA循环中的NAD+辅酶依赖型酶的辅酶特异性为NADP+，增加胞内NADPH含量；（3）通过改造α-酮戊二酸到精氨酸途径中脱氢酶辅酶依赖型为NADH，减少对NADPH的需求，进而提高精氨酸的产量。通过酶学性质验证和胞内辅酶含量的测定，确定最优代谢工程改造策略。这一研究思路对改造微生物辅酶再生途径机制以及其他氨基酸生产有一定指导意义。

L-精氨酸是一种具有多种特殊生理生化功能的半必需氨基酸，在医药、食品和保健品等领域应用广泛。Corynebacterium glutamicum SNK118是一株经过多次诱变筛选获得的L-精氨酸生产菌株。对其L-精氨酸合成途径和调控机制进行研究，基于辅因子工程改造C. glutamicum SNK118提高L-精氨酸的生产效率。L-鸟氨酸是L-精氨酸合成途径中的中间代谢产物，在食品，医药和保健品领域具有广泛的市场需求。基于CRISPR-Cpf1基因敲除技术对C. glutamicum SNK118进行辅酶代谢工程改造用于高产L-鸟氨酸。.为提高L-精氨酸生产途径中的关键辅酶NADPH的供给，将大肠杆菌来源的pntAB和C. glutamicum ATCC13032来源的ppnK进行串联表达。为解除L-精氨酸合成途径的反馈阻遏作用，敲除SNK118基因组的argR和farR基因。敲除代谢竞争途径的ldh基因（编码乳酸脱氢酶）。最终构建获得重组菌株JML07。对重组菌进行补料分批发酵，75 h可产L-精氨酸67.01 g·L-1，糖酸转化率达到0.35 g·g-1，生产强度为0.89 g·L-1·h-1，生产效率相对于出发菌株有了明显的提高。本研究提供了高产L-精氨酸的生产菌株及有效合成NADPH依赖型代谢物的辅因子改造策略。为切断鸟氨酸转化为瓜氨酸，并解除全局反馈阻遏调控的干扰，将SNK118基因组上的编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的基因argF和与其相邻的编码精氨酸阻遏物的基因argR同时敲除。为增强L-鸟氨酸合成途径中的所需关键辅酶NADPH的供给，将糖丁基梭菌来源的gapC和Bacillus subtilis HB-1来源的rocG引入C. glutamicum SNK118中。为缓解分支途径对丙酮酸的竞争，在构建好的菌株中敲除编码支链氨基酸通透酶的基因ncgl2228以抑制支链氨基酸的过量合成。经改造后的菌株在5-L发酵中罐发酵80 h可产L-鸟氨酸60.01 g·L‒1。10-L罐补料分批发酵72 h，L-鸟氨酸产量达到88.26 g·L‒1，糖酸转化率达到0.41 g·g-1，其中生产强度为1.23 g·L‒1·h-1。.通过辅酶代谢工程改造L-精氨酸产酸浓度较出发菌株提高66%，经改造后的鸟氨酸生产菌株较出发菌株提高27%。