蛋白激发子PeaT1在烟草细胞膜上受体蛋白的鉴定

PeaT1是一种来自于细极链格孢菌的蛋白激发子，能够提高植物对逆境的综合抗性，如抗TMV、抗旱、抗寒等。由于PeaT1本身并无毒害作用，不会对环境造成污染，因此可作为植物生物防治的一个新的研究方向。目前关于PeaT1作用机理研究已经发现，PeaT1能够改变植物细胞内一系列蛋白的表达水平和一些关键的防御性酶的活性，细胞定位实验发现PeaT1在细胞膜上存在结合位点，这提示着某种跨膜信号途径的存在。但由于PeaT1在细胞膜上的受体蛋白并未被明确鉴定，这严重阻碍了整条信号通路的阐明。本研究拟通过蛋白质相互作用的研究方法-Pull Down技术筛选PeaT1在烟草细胞膜上的受体蛋白，并通过质谱测序和RACE方法克隆其编码基因，明确受体蛋白的身份，从而为整条信号途径的阐明提供线索和依据。

PeaT1能够提高植物对逆境的综合抗性，前期研究表明在植物细胞膜上可能存在可与PeaT1蛋白相互作用的受体蛋白。本研究的主要研究内容是寻找PeaT1在烟草细胞膜上的受体蛋白，主要研究结果如下：.1. 烟草细胞膜蛋白的提取 进行烟草悬浮细胞培养，破碎后通过两相分离系统提取细胞膜蛋白；.2. GST-Pull down调取PeaT1受体蛋白 将烟草细胞膜蛋白进行适量酶切，与GST-PeaT1蛋白进行孵育结合，洗脱杂蛋白，得到目的受体蛋白。.3. 质谱鉴定受体蛋白 将目的蛋白进行双向电泳和Far western杂交后，得到阳性斑点。进而进行质谱测序，得到肽段信息。经过数据库比对搜索后确定目的蛋白为Drepp。该蛋白为跨膜蛋白，有报道称其参与了植物抗逆的信号通路传导。.4. Drepp蛋白的克隆与表达 根据Drepp蛋白的编码基因设计引物，以cDNA为模板扩增基因，并连接至pET28a表达载体中，在BL21（DE3）中进行表达，经过His-Tag亲和纯化，得到初步纯化的Drepp蛋白。.5. PeaT1的结构与Drepp蛋白的可能结合位点的分析 通过小角散射对PeaT1在不同温度的水溶液状态下的三维结构进行分析，确定PeaT1的NAC结构域为形成稳定二聚体的决定因素。由于NAC结构域的结构可变性差，其作为受体蛋白结合部位的可能性不大。而UBA结构域则柔性较好，可能是受体蛋白的结合部位。