HBV相关HCC新抗原特异性TCR介导的杀肿瘤活性研究

In our country, the incidence of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma (HCC) is high, and the options for effective therapeutic are lack. So new therapeutic approaches are urgently needed. Targeting of cancer neoantigen with specific T cell have shown the high specificity, efficient anti-tumor activity, and promising data in clinical treatment. Whereas data on HCC neoantigen-specific T cell receptor (TCR) and its antitumor activity are lacking. Our previous studies have analyzed TCR repertoires and specific TCR in tissues and peripheral blood mononuclear cells in patients with chronic hepatitis B, liver cirrhosis and HCC. In this project, based on our previous TCR data, HCC patients will be enrolled and studied. Through whole exome sequencing, RNA sequencing by next-generation sequencing, somatic mutations will be selected to stimulate and sort CD8+ T cells from tumor-infiltrating lymphocytes. Then TCR β and α sequences will be paired by single-cell analysis. The paired TCR β and α sequences will be cloned into retroviral vector MP71 and packaged with 293T. Autologous peripheral blood mononuclear cells from the patients will be transduced with retroviral supernatants. Neoantigen specific TCR-T will be cocultured with their corresponding autologous tumor cell lines, or will be intravenously injected into SCID mice with orthotopic HCC patient-derived xenografts. Immune assays including lactate dehydrogenase cytotoxicity and pathological analysis will be used for the final confirmation of antitumor acitivity of HCC neoantigen specific TCR-T. The identification of neoantigen specific TCR will do a great help on immunotherapy of patients with hepatitis B virus-associated HCC.

我国乙肝相关肝癌（HCC）患者数量多且治疗手段有限，亟需探索新的治疗方法。以肿瘤新抗原为靶点的特异性T细胞具有特异和高效的杀肿瘤活性，临床效果显著，但有关HCC新抗原特异性T细胞受体（TCR）介导的肿瘤杀伤活性研究数据欠缺。我们在前期研究中对慢乙肝、肝硬化以及HCC患者肝组织和外周血中TCR组库的组成和特点进行了对比分析，并对特异性TCR进行了研究。本项目将基于前期积累的大量数据，以HCC患者为研究对象，通过全外显子、转录组测序，突变表位对肿瘤浸润CD8+T细胞的刺激和分选，单细胞TCR αβ链配对和病毒包装，新抗原特异性TCR-T制备及系列免疫学实验，利用患者自体肿瘤细胞和自体肿瘤小鼠模型，研究HCC新抗原特异性TCR介导的肿瘤杀伤活性，为HCC患者精准免疫治疗的探索提供支持，具有重要的临床价值和意义。

我国肝细胞癌（HCC）的发病率和死亡率均较高，近年来开展了多种不同的治疗手段，但总体疗效有限，急需探索新的治疗方法。肿瘤新生抗原或肿瘤相关抗原特异性T细胞受体介导的T细胞（TCR-T）是治疗实体瘤的新手段，其良好的临床效果得到越来越多的临床验证，但如何有效筛选鉴定出可用于肿瘤治疗的抗原特异性TCR成为制约该技术在临床广泛应用的瓶颈。为此我们首先对100例HBV相关HCC患者癌组织和癌旁组织进行了外显子、转录组、HLA及免疫组库测序，分析HCC患者基因组突变和新生抗原情况；其次对HBsAg和HBcAg等HBV抗原特异性TCR进行了筛选。结果显示，患者的平均突变数量中位数为86.5，新生抗原负荷中位数为18，基因突变具有高度个体化特点，新生抗原在不同HCC患者间呈现高度异质性，不同患者难以产生相同的新生抗原。其次，在分析我国447例慢性HBV感染者不同疾病进展阶段HBV准种组成和序列变异的基础上，合成了HBV4种基因（S、C、P、X）多肽库，对8例HBV感染者外周血单个核细胞（PBMC）进行了肽库刺激培养、单细胞分选、TCR双链扩增测序、TCR克隆和特异性TCR筛选鉴定，获得了多个HBsAg特异性TCR。在此基础上，纳入259例HBV感染者和361正常人，通过对外周血中TCR组库的分析计算，建立HBV特异性TCR的算法。通过本项目的实施，明确了我国HBV相关HCC患者基因突变和新生抗原发生率，建立了抗原特异性TCR筛选鉴定技术平台，并获得了HBsAg特异性TCR，为下一步获得更多适用于我国HCC患者治疗的HBV特异性TCR提供了技术基础和可用的TCR，也为进一步研究慢性HBV感染者及HCC患者HBV特异性T细胞的存在状态及发育分化等提供了工具和数据。