18β甘草次酸逆转肝星状细胞免疫抑制活性干预肝癌微环境的研究

It has been an important issue to investigate the mechanism of hepatocellular carcinoma (HCC) development from the tumor microenvironment and then look for efficient target for targeted therapy drugs..We have recently demonstrated that HSC are key modulators of the immunosuppressed HCC microenvironment, and that this modulation is associated with decreased T-cell infiltration, increased apoptosis of tumor infiltrating mononuclear cells and up-regulation of Treg cells expression. Our findings clarify the relationship of HSC immunosuppression activity and HCC. Meanwhile we also find 18β glycyrrhetinic acid (GA) can effectively suppress the immunomodulation activity of HSC,and the mechanism of inhibition is unclear..To demonstrate the possible mechanism of GA in suppressing immune activity of HSC， we study the effect of GA-pretreated HSC on the activation，proliferation and apoptosis of immune cell,analysis the alteration of cytokines secreted by T cells and HSC and analysis the changes in T-cell function. Then we further establish HCC orthotopic implantation model in immunocompetent mouse and examine the expression of immune cells, HSC and cytokines in blood,spleen and tumor samples of tumor-bearing mice to discuss the meachanism of GA in inhibiting development of HCC by modulating the tumor microenvironment..This research will demonstrate a novel therapeutic strategy from a new perspective in targeted therapy for HCC by targeting stromal cells, an important member of HCC. And it will provide important enlightenment in the understanding the pathogenesis and targeted therapy for HCC and other cancers.

从肿瘤微环境探讨肝癌发生发展的机制，寻找高效的靶点及其可以靶向治疗的药物，是肝癌靶向治疗新的焦点。我们前期研究发现肝星状细胞（HSC）能够通过抑制T细胞浸润，诱导单个核细胞凋亡，以及促进调节性T细胞表达等营造局部免疫抑制微环境，促进肝癌发生发展。进而研究发现18β甘草次酸（GA）能有效逆转HSC的免疫抑制活性，具体机制未明。本项目采用GA处理HSC后，与淋巴细胞混合培养，通过研究免疫细胞活化、增殖与凋亡，检测HSC和T细胞分泌细胞因子水平，以及分析T细胞功能等，阐述GA逆转HSC免疫抑制活性的机制。进一步建立正常免疫小鼠肝癌原位移植模型，研究GA处理对HSC、免疫相关细胞及细胞因子的表达影响，揭示GA干预肝癌免疫微环境抑制肝癌的发生发展的机制。本项目以肝癌微环境中的重要基质细胞为靶细胞，从全新的角度阐明肝癌靶向治疗的新途径，对肝癌以及其它癌症的发生机制和靶向治疗研究，有着重要的借鉴作用。

肝星状细胞HSC能够营造局部免疫抑制微环境促进肝癌的发生发展。寻找可以逆转HSC的免疫活性干预肝癌的微环境抑制肝癌发生发展的药物，在未来有重要的应用前景。在本青年基金的资助下，我们取得了如下成果：1)我们发现18β-甘草次酸GA能够通过减少T细胞的凋亡和调节性T细胞的表达，逆转HSC对T细胞的免疫抑制特性；进而增加T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，并降低肿瘤细胞的侵袭能力。进一步的动物实验表明，GA能通过抑制HSC的活化从而阻止肿瘤的生长，减少血管、淋巴管的生成，并增强局部抗肿瘤免疫反应。相关成果发表在International Journal of Cancer。2)利用正常免疫小鼠的原位肝癌移植模型，我们发现活化的HSC能够抑制脾脏中T细胞及其亚群的表达，并促进脾脏以及肿瘤微环境中调节性T细胞Tregs以及髓系来源抑制性细胞MDSCs的表达，表明HSC能够促进负性免疫调控细胞的表达促进肝癌的发生发展，阐明了HSC促肝癌的新机制。相关结果发表在Laboratory investigation。3)为了进一步阐明HSC对免疫抑制细胞MDSCs的具体调控机制和作用方式，我们建立了流式分选荷瘤小鼠MDSCs的方法，为了进一步研究MDSCs亚群，我们还建立流式分选FACS和磁珠分选MACS分选脾脏PMN-MDSCs和Mo-MDSCs，并比较了这两种分选方法的异同点。相关结果发表在International journal of clinical and experimental pathology。4)我们发现HSC对MDSC的两个亚群具有不同的迁移效果。为了进一步阐明HSC诱导MDSCs亚群的机制，利用小鼠Chemokines & Receptors PCR Array的RT-PCR芯片检测了 PMN-MDSCs和Mo-MDSCs 84个基因的表达。84个基因包含了33个趋化因子和14个具有潜在趋化活性的因子，19个典型趋化因子受体和9个其他跟趋化性相关的重要基因。结果显示Mo-MDSCs的趋化因子及受体的基因表达谱要比PMN-MDSCs宽得多。CCR2、CXCR2分别为Mo-MDSCs 和PMN-MDSCs中表达最高的趋化因子受体，CXCR4 受体为两者都高表达的受体。相关结果发表在International Immunopharmacology。