光学新技术研究家蚕微孢子虫孢子发芽机制及其异质性

Novel optical techniques and single-cell analysis could help reveal the path of life activity, illuminate its functions and molecular mechanisms via detailed change of individual cells. Pebrine disease caused by infections, parasitic of Nosema (Nosema bombycis, N.b) is a traditional and destructive disease in sericulture. In this project, multi-focus laser tweezers Raman spectroscopy, phase contrast microscopy and fluorescence microscopy are used to analyze the real-time dynamic germination of hundreds of individual N.b spores, by monitoring the kinetics of intracellular trehalose and biomolecules of individual spores. This cross-disciplinary research project attempts to reveal: (i) the intracellular and intercellular heterogeneity of N.b spores. (ii) the kinetics of intracellular biomolecules of N.b spore germination in-vitro; (iii) the effect of physical and chemical agents on the N.b spores and spore germination，and its molecular mechanisms; and (iv) the heterogeneity of N.b spore germination and its mechanisms. The knowledge derived from this work will allow us to better understand the process of spore germination of N.b and its heterogeneity, and provide scientific help to develop new treatments to block or reduce the microsporidian infection of host. The results will also provide useful reference to single-cell analysis in biomedical field.

创新的光学技术与单细胞分析方法，能够通过监测单个细胞生理变化的细节获知生命活动途经并阐释其功能和分子机制。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，简称N.b)是家蚕微粒子病的病原真菌, 是养蚕业的严重威胁。本项目基于单细胞拉曼光谱、多细胞相差显微成像和荧光显微成像等光学新技术，实时监测和分析多个N.b单孢子发芽过程海藻糖的变化及胞内其它生物大分子的实时变化动态信息，获知：（1）不同微孢子虫胞内物质的异质性；（2）N.b孢子发芽过程孢内主要生物大分子的变化动态；（3）物理、化学因子对N.b孢子发芽的影响及其分子机制；（4）N.b孢子发芽的异质性以及造成这种异质性的机理。项目通过创新技术和创新方法了解N.b孢子的发芽规律和异质性，为认识微孢子虫的发芽机制与侵染机制，也为阻断或降低微孢子虫对寄主的侵染提供科学依据和理论参考。同时，项目的预期成果也为光学技术应用于生物医学单细胞研究提供借鉴。

家蚕微孢子虫Nosema bombycis（Nb）是人类最早发现的微孢子虫，引起蚕业生产上的毁灭性疫病——家蚕微粒子病的病原菌，因而被各国列为蚕种生产唯一的检疫病害。微孢子虫浸染是以其孢子发芽为基础。如果能找到安全的孢子发芽抑制方法，就可以阻断或降低微孢子虫侵染寄主的发生。另一方面，生物细胞的异质性，是微生物细胞能够适应并生存于逆境或持久生存并致病的基础，而常规的群体分析方法，得到的是反映群体孢子平均信息的认识，掩盖了具体的单个孢子的个体信息。因此，通过单细胞分析了解Nb孢子的异质性及其影响因子，设法让Nb孢子在基本相同的时间内发芽或者抑制其发芽，阻断或降低其侵染家蚕的机会，在桑蚕业乃至医学领域都具有特别重要的意义。.本项目探索利用基于相差成像和拉曼光谱的单细胞光学技术，对单个Nb孢子的异质性和发芽动态进行实时监测和分析，以期从光学和单细胞角度了解Nb孢子的基本生物学特征及其发芽机制、各种理化因子对Nb孢子的影响与机制。项目发现，基于相差显微成像和拉曼光谱的方法可以实时监测大量单个微孢子虫孢子发芽的进程，了解孢子的异质性；微孢子虫孢子富含海藻糖，其含量可能会影响到孢子的发芽，继而影响其对家蚕的感染力；孢子间存在明显的异质性，但与孢子的寄主类型没有相关性；Nb孢子发芽过程孢内海藻糖并没有明显的变化，而不同条件下Nb孢子的发芽都存在明显的异质性，主要体现在孢子开始弹射的时间点Tlag值上，但对发芽异质性机制的认识还有限；含氯消毒剂和醛类消毒剂等物化因子主要作用在孢子的外层，破坏孢子壁及其通透性，令海藻糖外泄，或者令外界因子无法通过孢子壁诱发孢子发芽。.项目成果为了解微孢子虫孢子的异质性和多样性，认识微孢子虫的孢子发芽与侵染机制，重新认识常规消毒剂对微孢子虫孢子的作用机制，建立阻断微孢子虫侵染寄主的有效途径提供了科学依据和理论参考，也为光学技术应用于生物医学单细胞研究提供借鉴。