miR-301a-PTEN-CCND1通路调控心肌细胞周期促进受损心功能恢复的机制研究

Cardiac injury and myocyte loss are the primary cause of heart failure in adult mammals. Reactivating cardiomyocytes to return the cell cycle is a key strategy for promoting myocardial cells regeneration and repair. Our previous work demonstrated that miR-301a is highly expressed in neonatal and fetal cardiomyocytes. Preliminary results confirmed that miR-301a overexpression in primary neonatal cardiomyocytes and H9C2 myoblasts could inhibit pten expression, and upregulate Cyclin D1 expression which promotes cardiomyocytes proliferation. We confirmed that intravenous injection of miR-301a promotes cardiomyocytes proliferation in mouse myocardial infarction model. On the basis of these findings, we hypnosis that miR-301a reactivates cell cycle and promote cell proliferation of cardiomyocyte through PTEN-CCND1 signal pathway thus restore the cardiac function. The aim of our work is to reveal the cellular and molecular mechanism of miR-301a in regulating cardiomyocytes proliferation by in vitro cell models and in vivo animal models. Finally, we will test the therapeutic effect of a cardiomyocyte specific cTnT promoter driven miR301a AAV9 vector in cardiac failure. Our study will provide novel therapeutic approach to the clinical treatment of heart failure.

心肌细胞损伤和补充不足是成年哺乳动物心脏受损进而心衰的主要原因。激活心肌细胞重回细胞周期是补充心肌细胞、促进心肌修复的关键策略。前期工作发现miR-301a特异高表达于乳鼠和胎鼠心肌细胞；心肌细胞过表达miR-301a能够抑制pten表达，上调CCND1，促进心肌细胞增殖；在成年小鼠心梗模型体内注射miR-301a，促进心肌细胞增殖。据此提出科学假说：乳鼠心肌细胞特异高表达的miR-301a通过调控PTEN-CCND1通路，重启心肌细胞周期，促进心肌细胞再生，进而改善受损心功能。本项目拟通过体外细胞实验、体内心梗动物模型以及过表达miR-301a转基因动物，揭示miR-301a促进心肌细胞增殖的调控机制；通过AAV9搭载cTnT启动子腺相关病毒载体特异靶向心肌细胞，验证miR-301a靶向给药对心衰的治疗效果。本研究结果将为利用miRNA重启心肌细胞周期，靶向治疗心衰提供实验依据。

心力衰竭是大多数心血管疾病的最终归宿，死亡率高。寻找激活成年心肌细胞重回细胞周期的有效方法，是补充心肌细胞、促进受损心肌修复的关键策略。本项目沿着立项主题和研究目标及研究内容，围绕miR-301a调控心肌细胞增殖的功能和机制展开研究。前期工作利用乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌细胞的高通量基因表达分析，筛选得到了miR-301a在具有增殖能力的乳鼠心肌细胞特异高表达；在体外构建了过表达miR-301a的H9C2心肌细胞株及乳鼠原代心肌细胞，正常培养及低氧培养环境（模拟心肌的缺血损伤）做对比，发现miR-301a可显著促进心肌细胞增殖，提高心肌细胞抗缺氧损伤能力；体内研究制备了心梗小鼠模型，以AAV9为载体，向心肌细胞靶向递送miR-301a，结果显示miR-301a体内给药可显著促进受损心脏的心功能恢复，显著减少心梗小鼠的心肌纤维化，并能诱导受损心脏的心肌细胞再生；机制研究通过生物信息学分析筛选到miR-301a下游靶基因及靶通路，通过荧光素酶实验、rescue实验、靶通路抑制实验及小鼠模型心脏组织中靶基因分析，证实了miR-301a对靶基因PTEN和PI3K/AKT信号通路的直接靶向抑制作用，揭示了PTEN/PI3K/AKT信号通路介导miR-301a调控心肌细胞增殖的分子机制；鉴于干细胞移植用于修复受损心脏的潜力，本项目还探讨了miR-301a调控小鼠胚胎干细胞(mES)向心肌细胞分化的作用及其机制，通过miR-301a过表达的mES细胞向EB拟胚体的形成实验，及心肌细胞特异标志物的检测，证明了miR-301a促进mES向心肌细胞的定向分化的功能，机制上证实了PTEN介导的mTOR-STAT3信号通路参与这个过程。以上研究成果不仅揭示了miR-301a调控心肌细胞增殖的功能及分子机制，同时证实了miR-301a调控胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用及机制，为促进受损心肌修复提供了新的可能途径，具有进一步研究探索、走向临床转化的潜力。