中国被毛孢拮抗马兜铃酸致肾间质纤维化的靶点：对Snail作用的研究

中国被毛孢可延缓慢性马兜铃酸肾病大鼠肾间质纤维化的进展，但其作用靶点至今仍未完全阐明。以往的研究表明肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（EMT）是马兜铃酸致肾间质纤维化的重要病理生理机制，Snail是启动EMT的关键作用分子。我们的前期工作已初步提示中国被毛孢可作用于EMT过程，而Snail可能是其拮抗马兜铃酸肾病的靶点。本项目拟对此做深入探讨，进行如下三部分实验：1. 观察中国被毛孢对原代近端肾小管上皮细胞中Snail生成与降解的影响；2. 观察中国被毛孢对近端肾小管上皮细胞中Snail位置、功能及调控的影响；3. 观察Snail在中国被毛孢拮抗慢性马兜铃酸肾病动物模型中的变化。该项目是我们以前有关马兜铃酸肾病及中国被毛孢拮抗马兜铃酸肾病系列研究工作的延续，本研究的结论将为中国被毛孢防治马兜铃酸致肾间质纤维化作用提供新的理论依据。

中国被毛孢（HS）可延缓慢性马兜铃酸（AA）肾病大鼠肾间质纤维化的进展，但其作用靶点至今仍未完全阐明。研究表明肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（EMT）是AA致肾间质纤维化的重要病理生理机制，Snail 是启动EMT 的关键作用分子。本课题通过细胞和动物实验，观察HS对Snail 生成与降解、位置、功能及调控的影响，对我们的假说“Snail 可能是HS拮抗AA致肾间质纤维化的重要靶点”进行验证。细胞实验：体外培养原代人近端肾小管上皮细胞（HKC），用AA 和/或HS刺激，应用实时定量逆转录聚合酶链反应和western blot方法检测HKC中α-SMA、CK-18、TGF-β1、Snail mRNA及蛋白质的表达情况。并以GSK-3阻断剂SB415286阻断GSK-3，应用western blot方法检测GSK-3及Snail蛋白质的表达，同时应用免疫荧光染色观察Snail的位置变化。与对照组相比，AA刺激组EMT效应指标α-SMA表达量显著上升（p<0.05）、 CK-18表达量显著下降（p<0.01）；EMT效应上游指标TGF-β1表达显著上升（p<0.05）、Snail表达显著上升（p<0.05）；调节Snail降解的GSK-3蛋白质表达下降。而HS干预后，上述效应均被抑制。阻断GSK-3后，HS抑制AA所致的Snail上调作用亦被抑制。免疫荧光染色可见对照组细胞Snail在胞浆内染色阳性，AA组细胞Snail在胞核内染色阳性，HS组Snail在胞核内聚集减少，阻断GSK-3后HS的这一作用被抑制。动物实验：雄性SD大鼠随机分为对照组、CAAN模型组、HS组，用实时定量逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学方法检测肾组织中TGF-β1、Snail的mRNA及蛋白质表达。与对照组相比模型组肾组织内TGF-β1，Snail的mRNA和蛋白质水平显著上调（P﹤0.05）；与模型组相比，HS组上述高表达的mRNA及蛋白质指标均被显著抑制（P﹤0.05）。通过上述研究提示HS可拮抗AA导致的Snail蓄积并进入细胞核，及其所触发的EMT作用。提示Snail是HS拮抗AA致肾间质纤维化的一个重要靶点。本课题是在前期工作基础上的的深入，主要通过体外实验探讨了HS拮抗AA致EMT的分子机制，相关研究国内外尚未见报道。