健脾消积方药预防肝细胞癌及对TGβ-1/smad 信号通路调控的研究

HCC prevention at present is the medical problem. TGF-β1 signaling pathway is closely related to the abnormal occurrence and development of hepatocellular carcinoma, micro environment of TGF-β1 and its receptor expression level changes can promote liver cancer through multiple ways. Our previous study found that Jianpi Xiaoji decoction could reduce the TGF-β1 hepatic precancerous lesion in rats expression, reduce the immune suppression, and prevention of hepatocellular carcinoma. But the recipe on our hepatocellular carcinoma (liver cancer common process - hepatitis cirrhosis) in different stages and hepatocellular carcinoma is closely related to the cell proliferation, apoptosis, angiogenesis, immune function and its influence factors how to control to the members of the TGF-β1 and the pathway of the role is not clear. This project using the DEN induced rat HCC can be simulated China hepatocarcinogenesis merits of each stage, to the square medicine intervention, through the detection method of molecular biology technology, a detailed discussion of the party in different stages and the proliferation of hepatoma cells, occurs in the rat hepatoma apoptosis and the relationship between the factors related to angiogenesis of hepatocellular carcinoma, immune function and each member of the TGF-β1/smad signaling pathway expression, clarify the recipe to prevent possible molecular mechanism of HCC.

肝细胞癌防治目前是医学界难题。TGF-β1信号通路异常与肝细胞癌的发生发展密切相关，微环境中TGF-β1及其受体表达水平的改变可通过多途径促进肝癌的发生。我们前期研究发现健脾消积方药可降低大鼠肝癌前病变中的TGF-β1表达，减轻其免疫抑制而预防肝癌发生。但该方药对我国肝癌发生的常见过程（肝炎—肝硬化—肝癌）的不同阶段与肝癌发生密切相关的细胞增殖、凋亡以及血管生成、机体免疫功能因素的影响及其如何对TGF-β1及其传导通路各成员的的调控而起作用尚不明确。本项目利用DEN诱导大鼠肝癌可摸拟中国肝癌发生各阶段的优点，予该方药干预，通过分子生物学技术检测方法，细致探讨该方对在大鼠肝癌发生不同阶段与肝癌细胞增殖、凋亡以及肝癌血管生成、机体免疫功能相关因素的作用及其与TGF-β1/smad信号传导通路各成员表达的关系，阐明该方药预防肝癌可能的分子机制。

本项目基本按计划实施，因动物实验周期长，风险较大，故增加了中药干预肝癌细胞的实验，发现健脾消积方（JPXJF）水提物可抑制肝癌细胞自噬，故我们对研究内容进行调整。通过⑴采用JPXJF含药血浆及其冻干粉干预肝癌细胞及裸鼠，证实其能抑制肝癌细胞及下调TGF-β1表达。⑵将不同浓度JPXJF干预肝癌细胞，结果自噬关键蛋白Beclin1表达下调，LC3Ⅱ表达上调，LC3II/LC3I比值增加，P62表达上调，通过感染过表达LC-3-GFP-RFP 的肝癌细胞自噬检测慢病毒，发现自噬体到自噬溶酶体的流动速度降低。证实了该方可阻滞自噬流发挥调控效应。⑶利用基因芯片检测该方干预肝癌SMMC-7721细胞后基因差异，并进行高内涵增殖筛选（HCS）等实验，发现HIST1H2BK是该方关键作用基因，消减后HIST1H2BK，肝癌细胞增殖增强，而凋亡受到抑制，提示该基因具有促进肝癌细胞增殖及抑制凋亡的功能。⑷采用了网络药理学分析及高效液相色谱等实验确定柚皮素是JPXJF发挥影响自噬的有效成分。通过“HIST1H2BK-柚皮素”关联分析发现ERα是柚皮素影响肝癌自噬的主要的作用靶点。但是JPXJF干预裸鼠及预防大鼠肝癌的实验未取得阳性结果。本项目研究内容尽管作了调整，但基本完成各项任务。取得以下成果：⑴揭示了JPXJF通过下调TGF-β1抑制肝癌细胞的增殖机制。⑵研究JPXJF抑制肝癌自噬的作用及阐明了JPXJF调节自噬的有效成分、靶点及上游的可能途径，诠释了中医“健脾理气”法防治肝癌的现代内涵。⑶采用基因芯片与网络药理学联合分析，在明确中药作用靶点及途径上另辟捷径，为研究中药复方作用机制提供了一种新方法。