活化T细胞核因子对三种状态下破骨细胞调节机制及中药干预的研究

在骨质疏松骨微环境中，OB与OC之间存在0B-0C耦联关系，在破骨细胞发育和分化过程中， NF-kB的受体激活剂RANK／TNF联结因子6配体(TRAF6)信号系统活化了NFAT，促进OC发育和分化，0B-0C耦联的平衡向0C倾斜，骨吸收超过骨形成。本项目以明确NFAT在骨质疏松模型大鼠椎体、OC培养体系、OB与OC共育体系中对OC的调节机制为切入点，在骨质疏松大鼠模型上给予慢病毒和补肾益髓中药进行干预，在两种细胞模型上给予慢病毒和中药血清进行干预，通过检测OC分化与功能关键基因靶点NFAT表达变化，同时观察反应破骨细胞分化与功能的TRAP、NFATc1、CTR、Cath-K 、MMP-9等主要指标及其mRNA表达变化，在分子水平阐明NFAT对在三种状态下OC的调节机制及补肾益髓中药在这一过程中的作用机理，为补肾益髓中药防治以OC相对或绝对亢进为病理基础的骨代谢疾病提供全面深入的理论依据.

本课题联合应用重组慢病毒技术，从分子水平阐明OC发育和功能的调节机理以及补肾益髓中药抗骨吸收的作用机制和效应环节，为防治以OC相对或者绝对亢进为病理基础的骨代谢疾病提供依据。.1、Licl和ly294002联合对VOX大鼠骨质疏松的影响.在GSK上游pi3k处添加抑制剂，实验中发现局部注射Licl和ly294002两种抑制剂能有效缓解去势大鼠的骨流失，联合应用比单一使用更有效。联合抑制(GSK)-3-Wnt/b-catenin和pi3k-akt两个通路可以显著改善骨密度且优于单一用药。体外实验发现，(GSK)-3-Wnt/b-catenin通路和pi3k-akt通路被抑制后破骨细胞分化均被抑制，成骨细胞在GSK)-3-Wnt抑制时增殖效果明显。这表明两种药物联合应用能有效促进成骨细胞增值和抑制破骨细胞分化，从而达到低浓度高药效结果，避免了药物浓度过大带来的副作用。.2、骨乐冲剂对成骨细胞作用.本实验研究结果表明骨乐冲剂能够抑制成骨细胞分泌RANKL，促进OPG的生成，进而竞争性抑制RANKL与RANK结合，抑制破骨细胞的分化与骨吸收功能。.3、骨乐冲剂对破骨细胞作用.本实验研究发现骨乐冲剂干预组与空白组比较，TRAP阳性细胞数显著减少，且骨乐冲剂对破骨细胞的分化以剂量依赖的方式呈现。在骨乐冲剂浓度评价中发现不同浓度的骨乐冲剂对细胞存活率没有影响。高、中、低剂量的骨乐冲剂含药血清培养前体破骨细胞，对骨吸收有明显抑制作用，且呈现剂量依赖性。在分子水平上骨乐冲剂可以抑制破骨细胞OSCAR的蛋白表达，且可以抑制前体破骨细胞OSCAR、NFATC1 mRNA的表达。.4、中药骨乐冲剂对去卵巢大鼠作用.骨乐冲剂制约TNF-a的合成和分泌，降低了TNF-a的活性，解除了与之作用相拮抗的TGF-βl的抑制作用，使TGF-βl含量增加，结果使破骨细胞的骨吸收活动减弱，成骨细胞的骨形成作用增强，改变了骨吸收大于骨形成的骨代谢负平衡状态，增加了骨量，达到防治骨质疏松目的。