乳酸菌菌影作为DNA疫苗包装载体诱导免疫应答的研究

DNA vaccine has unparalleled advantages of traditional vaccine, but "naked" DNA vaccines is difficult to be ingested, expressed and presented by APC, leading to a lower level of immune response, which limits its promotion and use. To solve this problem, it urgently need for safe and effective packaging and delivering vector. In this study, the phage of Lactobacillus casei is isolated. The lysis functional gene is cloned and transformed into Lactobacillus casei. The ghosts are prepared after inducing to express and pack DNA vaccine. The packaging condition is groped and optimized. The quantity of loading and the stability is detected. The location of the loaded plasmid by in situ hybridization. After transfection to macrophages and dendritic cells in vitro, the expression of the reporter gene (EGFP) are detected to analyse and evaluate the effect on the transfection efficiency of the ghosts as plasmid delivery vector. The level of specific immune response is detected after immunizing mice orally, subcutaneously or intramuscularly. The effect of Lactobacillus casei ghosts as packaging vector of DNA vaccine on immunity is analyzed. It provides a new technology platform to prepare a new safe and effective vector to elevate immunity level of DNA vaccine. Furthermore, experimental data and theoretical basis can be provided to study other gram-positive bacterial ghosts.

DNA疫苗具有传统疫苗不可比拟的优势，但"裸"DNA疫苗很难被APC摄入、表达并进行抗原递呈，导致免疫应答水平较低，限制了其推广使用。为解决该问题，亟需安全有效的包装递送载体。本研究通过分离干酪乳杆菌噬菌体，克隆其裂解功能基因，电转化干酪乳杆菌，经诱导表达制备干酪乳杆菌菌影，以其装载DNA疫苗，摸索优化包装条件，检测装载量并分析质粒装载的稳定性。经原位杂交技术对装载质粒进行定位，体外转染小鼠巨噬细胞和树突状细胞，检测报告基因（EGFP）的表达，分析评价菌影包装质粒对转染效率的影响。同时将装载DNA疫苗的菌影经口服、皮下注射和肌肉注射免疫小鼠，检测特异性免疫应答水平，分析干酪乳杆菌菌影作为DNA疫苗包装载体对免疫效果的影响。为研制新型安全、有效的递送载体，提高DNA疫苗的免疫水平，提供一个新的技术平台。同时，也为其他革兰氏阳性菌菌影的研制提供实验数据和理论依据。

DNA疫苗具有传统疫苗不可比拟的优势，但“裸”DNA疫苗很难被抗原呈递细胞摄入、表达并递呈，导致免疫应答水平较低，为解决该问题，亟需安全有效的包装递送载体。. 本研究分离获得一株L.casei ATCC 393烈性噬菌体(Lcb)，对其主要特性进行了研究。确定裂解基因后，将其插入到干酪乳杆菌表达载体pPG-2中，构建了重组乳酸杆菌表达系统，进行诱导后，通过改变诱导时间、温度、诱导剂种类和浓度、pH等，确定菌影制备条件。透射电镜和扫描电镜结果显示，菌影形成的孔洞主要位于中央和两端。分别采用Cy3标记的特异性探针和SYBR Green I荧光染料标记质粒装载菌影，激光共聚焦显微镜结果显示，质粒DNA装载位置位于菌影内部。将菌影装载SYBR Green I荧光染料标记的pCI-EGFP质粒，流式细胞术检测结果显示，荧光信号频率明显升高，表明菌影装载效率很高，荧光定量PCR检测表明，菌影对pCI-EGFP的最大装载量可达230.9 μg/mg。. 为进一步检测菌影作为DNA疫苗载体的免疫效果，构建了表达猪轮状病毒VP6蛋白的真核表达质粒pCI-PRV-VP6，将pCI-PRV-VP6质粒免疫小鼠，HBS为对照组。特异性抗体检测结果表明，pCI-PRV-VP6质粒组、菌影装载pCI-PRV-VP6质粒组均产生了特异性抗体，与对照组相比差异极显著（P<0.01），菌影装载组IgG抗体水平高于单独质粒免疫组，且组间差异极显著（P<0.01）。脾淋巴细胞增殖试验结果表明，免疫组淋巴细胞刺激指数(SI)显著高于对照组(P<0.01)，而对照组的淋巴细胞无明显刺激作用。流式细胞术检测Th细胞亚类，结果表明，干酪乳杆菌菌影作为DNA疫苗传递载体能改变Th1/Th2平衡。与单独免疫pCI-PRV-VP6质粒组相比，菌影装载pCI-PRV-VP6质粒免疫组的Th2细胞数显著高于Th1细胞，表明菌影作为质粒传递载体，可增强体液免疫应答水平。. 综上所述，本研究首次成功制备了干酪乳杆菌菌影，并摸索了菌影装载质粒的条件，为其他革兰氏阳性菌菌影的研制提供了实验数据和理论基础。干酪乳杆菌菌影装载质粒后，定位于菌体内部。动物试验表明干酪乳杆菌菌影对DNA疫苗的免疫具有调节作用，为研制新型、安全、有效的递送载体，提高DNA疫苗的免疫水平，提供了一个新的技术平台。