李斯特菌载体多阶段结核疫苗体系的构建及其诱导免疫应答与效果的研究

Currently proposed multistage tuberculosis vaccine combining preventive and therapeutic effects against both active and latent tuberculosis, has become an important study subject in tuberculosis vaccine field. But the immunogenicity and antigenic gene constitution of currently reported multistage tuberculosis vaccine need to be further studied. In this project, attenuated Listeria monocytogenes (LM) and Listeria ivanovii (LI) which have confirmed effects on inducing robust specific CD4+ Th1 and CD8+ T cell immune response will be used as vaccine vector to construct vaccine in order to enhancing the vaccine immunogenicity. Notably, our team is the first to use LI as vaccine vector. Regarding antigenic gene constitution, a widely confirmed Mycobacterium tuberculosis pressure response gene Rv2460c, being relevant to latent infection and infection reaction is for the first time chosen as antigenic gene. A fusion antigenic gene fused with Rv2460c, Rv2660c, Rv3875 and Rv3804c will be used to construct a novel LM/LI based multistage tuberculosis vaccine system. To evaluate the immune responses induced by the multistage vaccine, the mice will be intravenously, intragastrically or intranasally administrated the above vaccine, via several immune strategies, including BCG prime and LM/LI boost strategy. After immunization, studies will focus on elucidating the preventive and therapeutic immune responses induced by vaccine and the biosafety of the vaccine. The protection against M. tuberculosis infection and therapy for tuberculosis will also be explored in this project. This work will supply substantial and reliable data for next preclinic trial, and is the basement for success in developing safe and efficacious multistage tuberculosis vaccines.

同时针对活动性及潜伏性结核，兼具预防与治疗功效的多阶段结核疫苗逐渐成为结核疫苗研发的重要方向，但还需在免疫原性及抗原基因选择等方面进一步深入研究。为增强疫苗免疫原性，项目组以能强效激活特异性CD4+ Th1和CD8+细胞免疫应答的减毒单增(LM)和绵羊李斯特菌(LI)作为疫苗载体，其中将LI作为疫苗载体为首创专利技术；在抗原基因选择上，首次将结核杆菌潜伏性感染和复发相关基因Rv2460c作为抗原基因组成融合基因构建新颖的LM/LI载体多阶段结核疫苗体系；采用包括BCG prime-LM/LI boost等多种策略免疫小鼠；除静脉免疫外，还探索呼吸道和胃肠道免疫途径的可行性和效果，重点系统研究疫苗诱导的预防性和治疗性免疫应答谱学特征及安全性，初步探讨疫苗的免疫保护和免疫治疗效果，为下一步临床前期试验提供充实可靠的数据，并为最终研发出安全、有效、符合多阶段疫苗理念的结核疫苗奠定坚实的研究基础。

由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的结核病（Tuberculosis, TB）仍是威胁全球人类健康的重要公共卫生问题。BCG作为全球范围内唯一有效的结核疫苗，对婴幼儿能提供较好的保护效果，但对成人来说，BCG的保护效果却有限。因此，本项目在卡介苗已有的高接种率和保护性的基础上，研发一种安全有效的异源性增强疫苗，以全面预防和根除TB。.MTB感染过程分为原发性感染、潜伏性感染（latent tuberculosis infection, LTBI）和原发后感染等不同阶段，不同阶段的蛋白表达谱差异很大。研究表明，选择MTB不同感染阶段的特征性蛋白构建融合蛋白疫苗，可建立针对不同感染状态下MTB的特异性免疫应答，从而既能保护健康人群免受感染，还能有效控制清除LTBI人群和活动性TB患者体内的MTB，这种疫苗研发思路被称为多阶段疫苗。.故本项目选用MTB感染后不同阶段的特征性蛋白为抗原，筛选各抗原基因上T细胞表位融合构建多阶段结核抗原基因，分别以绵羊李斯特菌（Listerria ivanovii，LI）野生株和减毒株、单增李斯特菌（Listerria monocytogenes，LM）减毒株为疫苗活菌载体，将多阶段结核抗原基因整合至李斯特菌基因组特定位置，成功构建了3株不同的多阶段结核疫苗候选株，组成联合的疫苗体系，并评价该疫苗体系对小鼠的安全性、免疫效果和免疫保护效果。结果表明，3株疫苗候选株均具有一定的生物安全性并能诱导特异性细胞免疫应答。对比了9种不同的免疫策略后，结果表明初免-异型加强免疫策略诱导产生的免疫反应强于初免-同型加强免策略，其中LM△-msv→LI△-msv免疫策略的效果最佳，可有效提高特异性分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2 的CD8+ T细胞比率。因此，将LM△-msv→LI△-msv作为BCG的加强疫苗组合，结果表明与BCG单次免疫组相比，李斯特菌多阶段结核疫苗加强免疫对攻毒小鼠具有较强的免疫保护性，其保护性有赖于能够诱导稳定、持久的与多阶段抗原相关的特异性CD8+ T细胞免疫应答水平。这些结果提示，李斯特菌疫苗体系能够弥补BCG无法有效诱导CD8+T细胞免疫应答的不足，增强了BCG的免疫应答水平和免疫保护性，是具有良好应用前景的候选疫苗。