TLR2信号通路在肠道共生乳酸菌为载体的鸡球虫疫苗免疫应答中作用机理研究

从健康SPF雏鸡盲肠中分离、鉴定乳酸菌，经选择培养基选育获得胸苷酸合成酶（ThyA）基因缺陷型乳酸菌菌株作为受体菌。构建并鉴定携带抗鸡艾美尔球虫保护性抗原的以ThyA基因为选择标记的食品级非抗生素抗性乳酸菌表达质粒，电转化入目的受体乳酸菌中，获得可表达外源基因的重组阳性乳酸菌。经口服免疫SPF雏鸡后，攻击感染柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊，对各组试验鸡脾脏和盲肠扁桃体中T淋巴细胞亚型数量，巨噬细胞表面、淋巴细胞表面Toll样受体2（TLR2）及其信号通路中主要相关分子，以及细胞免疫应答中重要细胞因子的mRNA表达进行定量研究，旨在揭示重组阳性乳酸菌口服免疫雏鸡后诱导的免疫保护应答与TLR2及其信号通路中相关分子、相关细胞因子之间的内在关系，为鸡艾美尔球虫口服乳酸菌疫苗的研制及Toll样受体信号通路在疫苗免疫应答中的作用机理研究提供崭新参考素材。

从健康SPF雏鸡盲肠中分离到一株性能优良且可以作为受体菌表达异源蛋白的乳酸菌菌株LabmdxA。将经动物免疫实验证明具有良好免疫原性的鸡柔嫩艾美尔球虫（E. tenella）子孢子抗原3-1E基因参照乳酸菌密码子偏好性进行优化，优化后的3-1E基因片段插入乳酸菌表达载体pTX8048中获得重组阳性质粒pTX8048-3-1E，电转化入分离的鸡源肠道共生乳酸菌LabmdxA中，获得重组乳酸菌LabmdxA pTX8048-3-1E，经nisin诱导后采用Westernblot方法成功检测到了目的蛋白在重组菌中的表达。将LabmdxA pTX8048-3-1E口服免疫SPF雏鸡后，攻击感染5×104 E. tenella孢子化卵囊，结果表明重组菌LabmdxA pTX8048-3-1E免疫后可提供抗同源感染的免疫保护作用。免疫后，LabmdxA pTX8048-3-1E免疫组鸡外周血和脾脏T淋巴细胞增殖水平，外周血和脾脏CD8+T淋巴细胞亚型数量，脾脏Toll样受体2（TLR2）信号通路相关分子ChTLR2-2，Ch NF-κB和ChIL-2 mRNA相对表达量均显著高于LabmdxA pTX8048组；感染后6天，LabmdxA pTX8048-3-1E免疫组鸡脾脏ChTLR2-2和ChNF-κB mRNA表达量极显著高于空白对照组。以乳酸菌LabmdxA基因组DNA为模板扩增thyA基因不完整片段（ΔthyA），ΔthyA片段插入同源整合载体pGhost中获得质粒pGhostΔthyA，电转化入LabmdxA中，经筛选获得thyA基因缺陷乳酸菌LabmdxAΔthyA。将thyA基因完整片段插入质粒pTX8048-3-1E中，取代氯霉素抗性基因片段，获得含thyA基因的乳酸菌表达质粒pTX-T8048-3-1E，pTX-T8048-3-1E经电转化入受体菌LabmdxAΔthyA中，经筛选获得了阳性目的菌株LabmdxAΔthyA-pTXT8048-3-1E。研究为鸡艾美尔球虫乳酸菌口服疫苗研制，免疫机理以及将来在生产中的应用奠定基础。