基于TLR4-Syk-TRAF6通路抑制的虎杖二苯乙烯类化合物抗骨关节炎作用及机制研究

It has been proved that Toll-like receptor 4 (TLR4) mediates the innate immune response through TLR4-Syk-TRAF6 pathway in early osteoarthritis (OA). Spleen tyrosine kinase (Syk) plays a key regulatory role on this pathway. Our previous studies have shown that, stilbenes (STBs) from Polygonum cuspidatum down regulate the expression levels of Syk and TRAF6, reduce levels of inflammatory cytokines and relieve cartilage damage. However, the detailed regulatory mechanism of STBs on this pathway has not been fully understood. A hypothesis is therefore suggested here: STBs control osteoarthritis progression and inflammatory cytokines via inhibiting TLR4-Syk-TRAF6 pathway. To verify this hypothesis, experiments on in vitro and in vivo OA models will be designed from the following three aspects: (1) potential anti-OA effects of STBs are evaluated by levels of inflammatory cytokines and matrix metalloproteinases; (2) inhibitory effects of STBs on TLR4-Syk-TRAF6 pathway are proved by protein phosphorylation and protein–protein interactions which participate in this pathway; (3) STBs' binding target is confirmed via Syk overexpression and Syk silencing. Our studies will clarify the detailed protection mechanism of STBs as Syk inhibitors on OA, and provide abundant data for further development of disease-modifying osteoarthritis drug.

TLR4-Syk-TRAF6是启动骨关节炎（OA）早期固有免疫应答的核心通路，Syk是关键调节蛋白。我们前期证实虎杖二苯乙烯类化合物（STBs）可抑制Syk活性，下调TRAF6表达，有效减轻OA症状。然而STBs抗OA的作用机制尚未完全阐明，故提出假说：虎杖STBs可能通过抑制TLR4-Syk-TRAF6通路控制OA进展。为验证假说，拟建立OA大鼠和细胞模型，以STBs靶向抑制Syk为切入点，以通路节点蛋白为指标，以“抑制-激活”通路展开：①抗OA效应评估：采用液相芯片等技术明确炎症和软骨代谢相关蛋白的表达；②通路调控：采用免疫共沉淀等技术明确通路蛋白的相互作用和磷酸化水平；③靶点验证：采用Syk过表达和siRNA 干扰等技术，验证STBs调控通路的确切位点和作用机制。本项目旨在阐明STBs经TLR4-Syk-TRAF6通路对OA的调控作用与机制，为研发针对通路的中药小分子抑制剂打下基础。

对二苯乙烯类化合物活性靶点的生物信息学分析表明：它们具有广泛的抑制炎症作用，主要通过Th17分化、T细胞受体信号、Toll样受体信号等通路，进而调控肥胖、疼痛、骨肉瘤、关节炎、骨与脊柱变形等相关疾病。这主要与其调控蛋白激酶、磷酸转移酶、丝苏氨酸蛋白激酶、细胞因子受体结合等活性有关。对虎杖二苯乙烯类化合物的生物信息学分析表明resveratrol等调控靶点集中在骨与软骨疾病上。我们制备收集虎杖二苯乙烯类化合物及衍生物，采用巨噬细胞和软骨细胞模型，评估它们的活性，结果表明虎杖二苯乙烯类化合物均有较好的抗炎和软骨保护作用。采用MIA诱导的动物骨关节炎模型同样表明其具有良好的改善OA症状效果，因而值得进一步研究与开发。我们对其作用机制进行详细阐明。在细胞模型中阐明TLR4启动骨关节炎(OA)早期固有免疫应答，并发现Syk-TRAF6是其下游通路。这充实了OA早期慢性低程度炎症爆发的机理研究，第一次阐明TLR4-Syk相互作用在OA中的作用。因而TLR4-Syk-TRAF6可以作为改善OA早期病情、延缓疾病进程的药物调节切入点。而Syk作为主要激酶，是一个治疗早期OA的潜在靶点。虎杖二苯乙烯类化合物均可不同程度的抑制Syk的活化，其中Vam3效果最好。其对TLR4-Syk-TRAF6通路起到调节作用，进而改善炎症和软骨降解等病理改变。虎杖二苯乙烯类化合物可以改善慢性低程度炎症引起的关节疾病，值得进一步研究与开发。