棉铃虫CYP6AE14启动子中棉酚应答区域及应答核心元件的研究

植物与昆虫在相互作用的过程中相互间能"偷听"信号，其中植物次生物质是昆虫感受的最重要的信号之一，植食性昆虫取食植物时通过接收和转导寄主植物的防御信号，不断地调节自身反防御系统- - 细胞色素P450酶系应对不断增强的植物防御。目前对于昆虫如何通过接收和转导植物次生防御物质信号、上调自身反防御系统还不清楚。棉铃虫CYP6AE14基因在棉铃虫中肠高度表达，能被棉酚专一诱导，与棉酚的解毒有关。本研究拟以CYP6AE14基因作为模式材料，对植物次生物质信号传递途径进行研究，运用分子生物学技术克隆CYP6AE14 基因的启动子区，明确调控CYP6AE14 基因基本表达和棉酚诱导表达的顺式作用元件的数量及位置，确定CYP6AE14启动子中对棉酚诱导起关键作用的顺式调控元件，为识别在棉酚诱导的该基因转录调控中起关键作用的转录因子提供理论依据，继而以这些因子作为靶点研发新药、干扰昆虫的反防御防治害虫奠定基础。

细胞色素P450单加氧酶系在调节昆虫和植物的相互关系中起着非常重要的作用。所有的植物都会利用P450s合成有毒的防御化合物(如植物次生物质)，而植食性昆虫也利用P450s代谢这些植物次生物质。本研究利用基因组步移法得到棉铃虫CYP6AE14基因的启动子（1453bp），然后利用生物信息学软件对CYP6AE14基因5'侧翼序列特征进行了分析，构建了一系列不同长度片段的缺失报告基因重组载体，这些载体被瞬时转染进美洲棉铃虫脂肪体细胞，双荧光素酶报告实验系统被用来检测其活性。结果显示CYP6AE14基因启动子区1453bp片段不仅有基础的启动子活性，也能被植物次生物质棉酚gossypol诱导。5'缺失结果显示，CYP6AE14 基因启动子区存在3个增强子(-1175 to -916, -916 to -782, 和 -247 to -78)，3个沉默子（-1433 to -1175，-400 to -247和-78 to -42）和1个必需的调控元件（-42～-31）。-42～-31区域（XRE-Gos）的缺失突变结果表明，XRE-Gos元件对CYP6AE14启动子的基本活性和棉酚诱导活性是必需的。EMSA分析表明，XRE-Gos元件和美洲棉铃虫脂肪体细胞的核抽提物特异性结合。这些结果都表明CYP6AE14启动子的基本活性和棉酚诱导活性主要被XRE-Gos调节，其次被启动子区的其他顺式作用元件调节。本研究进一步阐明了棉铃虫对寄主植物防御性次生物质的适应性机理，为干扰昆虫的反防御进行害虫防治奠定基础。