棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6基因启动子中2-十三烷酮应答区域及应答核心元件的研究

2-十三烷酮是广泛存在于茄科植物当中的一种防御性植物次生物质，它可以诱导许多害虫解毒酶活性增加而降低杀虫剂的防效。细胞色素P450是棉铃虫代谢植物次生物质及杀虫药剂等外源化合物的重要酶系，对P450基因的转录调控机制进行深入研究具有重要的理论和实践意义。本项目将：（1）分析2-十三烷酮诱导棉铃虫中肠CYP6B6基因表达的时间和剂量效应，确定2-十三烷酮诱导胁迫下棉铃虫CYP6B6基因原位转录水平；(2)克隆棉铃虫CYP6B6基因启动子并对其进行生物信息学分析；（3）用荧光素酶报告基因系统分析棉铃虫CYP6B6启动子中2-十三烷酮应答区域；（4）利用凝胶阻滞电泳确定CYP6B6启动子中2-十三烷酮应答的核心元件，探明包含2-十三烷酮诱导型启动子的转录调控功能。本研究对阐明CYP6B6基因的表达调控，揭示棉铃虫对寄主植物防御性次生物质的适应性机理,提高对棉铃虫有效控制具有重要意义。

细胞色素P450在昆虫应对异源有毒物质的解毒过程中发挥着重要的作用，但昆虫细胞色素P450可被化学杀虫剂、植物次生性物质等所诱导。本项目研究了植物次生物质2-十三烷酮对棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6的诱导作用，并对调控CYP6B6表达的启动子区域进行了深入研究。. 采用免疫组化和荧光定量的方法研究了CYP6B6基因的表达情况，结果表明CYP6B6基因不仅在棉铃虫的中肠、脂肪体体壁和头壳中表达，也在其卵中表达，同时均可被2-十三烷酮诱导过表达。为了进一步探讨2-十三烷酮诱导其过表达的调控机制，首先利用基因组步移法得到CYP6B6基因的启动子（1333bp）(GenBank登录号：HM565970)，继而用荧光素酶报告基因分析系统研究棉铃虫CYP6B6 基因启动子中2-十三烷酮应答区域，结果显示CYP6B6基因启动子缺失片段不仅有基础的启动子活性，也有2-十三烷酮诱导的启动子活性，且在诱导后启动子的活性均升高，其中以Kpn-778（﹣373 ～﹢405bp）的启动子活性最强，差异极显著，揭示CYP6B6基因启动子上的﹣373～-171bp区域可能含有2-十三烷酮的应答片段；同时，在-577～-373bp区域可能还有调控该基因表达的抑制子。随后分别将CYP6B6基因启动子上两个片段−292 ～ −154 bp 和 −373 ～﹢21 bp进行地高辛标记后，与提取的核蛋白进行结合反应，凝胶阻滞结果表明两个片度均能与核蛋白进行特异性结合，揭示CYP6B6基因启动子上−292 ～ −154 bp区域为2-十三烷酮应答核心区域。进一步明确了植物次生物质2-十三烷酮对CYP6B6的诱导过表达作用及其调控表达，诠释了棉铃虫成灾机理、植物次生物质与害虫猖獗危害的关系，为棉铃虫的抗药性理论和控制技术研究提供必要依据。