植物次生物质诱导棉铃虫CYP321A1基因表达响应转录因子的识别及功能研究

Plants and their herbivores can 'spy' reciprocal defense signals in their coevolution. They use signals from the other side to escalate their defense or counterdefense. However, how insects detect and transduce allelochemicals into elevated counterdefense phenotypes remains largely a mystery. Previous studies demonstrate that the cis-acting element (XRE-Fla) are necessary for the basal and flavone-induced expression of CYP321A1, which is composed of two reversely orientated, overlapping antioxidant-response elements (ARE). In vertebrates, ARE are recognized and activated by the nuclear factor-erythroid-2-related factor 2 (Nrf2) upon oxidative or electrophilic stimuli. To examine the central hypothesis that transcription factor Cap`n'Collar isoform C (CncC), the insect authentic homologue of vertebrate Nrf2, regulate flavone induction of CYP321A1 in Helicoverpa armigera, following objectives are proposed: (1) To clone CncC, creat CncC-pAC reconstruction plasmids and synthesize double-stranded RNA (dsRNA); 2) to elucidate function of CncC responsive to plant allelochemicals induction of CYP321A1 in H. armigera by ectopic expression of H. armigera CncC (i.e. gain-of-function analysis) in H. zea fatbody cells, silencing of the endogenous H. armigera CncC (loss of function analysis) and Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). The proposed research is novel and original. Understanding for the entire signaling pathway may lead to novel, bio-rational pest control methods.

植食性昆虫与寄主植物相互作用时，彼此利用从对方探测到的信号物质快速的上调自身的防御系统，但植食性昆虫如何接收和转导植物防御物质信号上调自身反防御系统仍不清楚。前期我们研究表明，必需元件XRE-Fla 调节棉铃虫CYP321A1 基础和黄酮诱导表达，XRE-Fla由两个反向并部分重叠的ARE元件组成。在脊椎动物中，当受到氧化或亲电刺激时，ARE被核转录因子Nrf2识别并激活。本项目拟对植物防御次生物质黄酮高度诱导棉铃虫反防御基因CYP321A1表达的响应转录因子进行识别及功能分析，通过Race技术克隆获得Nrf2同源蛋白CncC基因全长cDNA序列，构建表达载体及dsRNA，通过功能获得分析、功能失去分析以及XRE-Fla与棉铃虫CncC蛋白的结合分析等，明确该转录因子在植物次生物质诱导CYP321A1基因转录中的作用，为设计新的、环境友好的、更加有效的害虫防治策略提供思路。

棉铃虫是重要的世界性农业害虫，取食多种寄主植物，为了克服植物防御，进化形成了尖端的防御系统（解毒酶系）进行反防御。我们前期研究发现黄酮（flavone）和花椒毒素（xanthotoxin）诱导CYP321A1表达主要受控于一个位于其启动子区域（-110～-86）的24bp长的ARE-like元件。Keap1/CncC-ARE信号通路是昆虫抗氧化以及抵抗外来损伤、参与代谢解毒的重要通路之一。本项目对植物防御次生物质诱导棉铃虫反防御基因CYP321A1表达的响应转录因子进行识别及功能分析。1）棉铃虫CncC和Keap1基因克隆及功能分析。结果表明，HaCncC基因在棉铃虫中肠的表达量最高，在头部和前肠也呈较高的表达水平。HaKeap1基因在棉铃虫的中肠表达量最高，在其他组织的表达水平均较低。HaCncC基因在1龄幼虫中转录水平最高，随龄期表达量降低，到5龄期转录水平升高。HaKeap1基因在卵中表达量最高，随龄期增加表达量逐渐降低。黄酮诱导后，棉铃虫中肠HaCncC基因的转录水平显著升高。花椒毒素诱导后，棉铃虫中肠和脂肪体中HaCncC基因的转录水平均显著升高。黄酮和花椒毒素处理后，棉铃虫中肠HaKeap1基因的转录水平无显著性变化，而脂肪体中HaKeap1基因的表达水平显著性降低。HaCncC的异位表达、细胞和虫体中HaCncC的RNA干扰结果表明HaCncC蛋白对于黄酮和花椒毒素诱导的CYP321A1基因的转录是至关重要的。2）对该信号通路中的另一个转录因子Maf-s进行研究。结果表明，HaMaf-s基因在棉铃虫中肠和脂肪体中高度表达，在头部也有较高的表达水平，在表皮中的表达量最低；HaMaf-s基因在棉铃虫各龄期均有表达，在四龄和五龄期表达量较低。黄酮和花椒毒素诱导后，棉铃虫中肠HaMaf-s基因的转录水平与对照相比均显著升高。转录因子Maf-s的RNAi结果表明，转录因子Maf-s影响黄酮诱导的棉铃虫CYP6AE19、CYP6B7、CYP321A5、CYP324A7、CYP321A1、CYP6AE14和GSTD1基因的表达，同时也影响花椒毒素诱导的棉铃虫CYP6AE19、CYP6AE20、CYP321A1、CYP6AE14和CYP18A1基因的表达。