WC-like蛋白介导的三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素合成基因转录的光调控机制研究

Blakeslea trispora, an industrial microorganism within the order of Mucorales for β-carotene production, is a heterothallic zygomycete with two mating types (+) and (-). Little research is focused on the mechanism of carotenoids biosynthesis regulation due to the obstacle of genetic manipulation. We proposed hypothesis on the light-dependent transcriptional regulation of carRA and carB genes based on the fact that β-carotene is light inducible as well as the experimental results we have obtained in Blakeslea trispora. With the methods of biochemistry, biophysics and molecular genetics, we will make an intensive study of the following three aspects: (1) The physiological function of crgA, cry-DASH and wc-like genes and the ways by which the light regulate them. (2) Identification of the specific binding complexes formed between the carB-carRA intergenic region and dynamic analysis of component during carotenoids biosynthesis both in the light and dark conditions. (3) The behavior of WC-like proteins after light induction and effect on transcription of carB-carRA gene. We will examine whether the behavior and destination of protein complexes could affect the carRA and carB transcription. The research will not only contribute to underlying the CrgA and WC-mediated light-dependent transcriptional regulation of genes in Blakeslea trispora carotenoid biosynthesis pathway, but also will promote the development of the basic research on Blakeslea trispora.

三孢布拉氏霉菌是接合菌纲毛霉目的一种具有性生殖的丝状真菌，也是目前极具优势的番茄红素等类胡萝卜素生产菌株，但关于该菌类胡萝卜素合成调控的分子机制研究寥寥无几。本项目针对类胡萝卜素合成受光调控的特性并结合前期结果，围绕该菌类胡萝卜素合成途径关键基因carB-carRA转录的光调控方式提出假设，采用生物化学、生物物理学和分子遗传学技术，以转录因子crgA和wc-like基因为重点进行（1）crgA, cry-DASH和多拷贝wc-like基因受光调控的程度以及在光调控下发生响应的相互作用蛋白；（2）carRA-carB双向启动子结合复合物的鉴定及不同条件下动态分析；（3）受体蛋白接受光信号后的行为及其对光诱导carB-carRA转录的影响。预期得到WC-like蛋白介导的三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素合成基因转录的光调控机制，对揭示该菌类胡萝卜素代谢流的控制方式和菌株途径改造有重要意义。

三孢布拉氏霉菌是接合菌纲毛霉目的一种具有性生殖的丝状真菌，从该菌的色素产量高、生长旺盛、发酵过程易于控制等生理特征来看，也是目前极具优势的番茄红素等类胡萝卜素生产菌株。但是由于该菌是无隔、多细胞核的丝状真菌，对菌株进行遗传改造后同核体筛选极其困难，国内外研究主要集中在诱变育种和发酵生产领域，关于该菌类胡萝卜素合成调控的分子机制研究很少，这也严重阻碍了代谢工程改造菌株更好的发挥潜能。本项目另辟蹊径，从类胡萝卜素合成受光调控的特性出发，针对该菌类胡萝卜素合成途径关键基因carB-carRA的转录，深入系统的研究了的光调控过程中的关键问题。成功的完成了6项研究内容：（1）分离并鉴定了三孢布拉氏霉菌中的光受体蛋白基因；（2）确定了Cry-DASH参与蓝光信号接收和光修复这两种生物学功能；（3）将外源基因和基因打靶片段成功的导入了菌体并获得了基因缺失突变体，但是尝试多种方法后未获得同核型，进一步分析了三孢布拉氏霉菌不能获得同核型的原因和突破点；（4）诱变筛选了多个光响应缺失突变体，确定了在光调控中的功能研究；（5）分离得到了carRA-carB双向启动子结合蛋白；（6）基于蓝光调控转录组测序的调控信息挖掘了光调控的网络协同机制。证明了光响应受体蛋白Bt_8353p和Bt_10740p能够在体外形成WCC（MAD）复合物，，同时在蓝光条件下其mRNA水平分别提高了7.4倍和173倍，证明了这两个蛋白是形成光复合物的关键蛋白，复合物中的Bt_8353能够与类胡萝卜素合成关键基因carRA-carB双向启动子结合来启动基因转录。本项目的研究结果从全基因水平上揭示了三孢布拉氏霉菌在黑暗和蓝光诱导过程中的基因转录差异，分析了菌株对蓝光的诱导响应、信号传递、能量合成、次级代谢等途径的影响和可能的机制。在国内外关于这个多细胞核丝状真菌研究很少的现状下，做了很多尝试，积累了大量基础数据，在稳定的遗传操作筛选同核型菌株不能实现的现状下，这些都为揭示了该菌株的蓝光诱导的转录调控网络和蓝光响应的脉络奠定了基础。