三孢布拉霉感光系统及其介导的类胡萝卜素生物合成分子机制

Blakeslea trispora can accumulate a large number of carotenoids, so the economic value of this microbe is significant. The synthesis of carotenoids in B. trispora is regulated by light. However, the research on the photoreceptor system and its regulatory mechanism for carotenoid synthesis in B. trispora is very scarce, which restricts the development of B. trispora photobiology and higher level biosynthesis of carotenoids in B. trispora. This application is to be aimed at the above issues in order to lay a foundation for the development of the theory and technology of carotenoid synthetic biology. 1) Identification and functional analyses of photoreceptors from B. trispora (-) mating type; 2) Based on the analyses of subcellular localization, binding of photoreceptors and light response elements to clarify the mechanisms for photoreceptor-mediated carotenoid synthesis; 3) Based on the analyses of photo cycle effect of VVD, correlation of wc-1, wc-2 and vivid in the levels of gene expression and interaction of corresponding proteins to explain "light adaptation" mechanisms for carotenoid synthesis; 4) Based on the analyses of CrgA domain function, the relationship between wc-1, wc-2 and crgA in the levels of gene transcription and protein expression, subcellular localization of CrgA, interaction of CrgA and photoreceptor proteins to reveal the mechanisms for photoreceptor-mediated carotenoid synthesis regulated by CrgA.

三孢布拉霉能大量累积类胡萝卜素，经济价值显著。三孢布拉霉合成类胡萝卜素受到光照的重要调控作用，然而该菌中关于光受体系统及其介导的类胡萝卜素合成机制的研究非常缺乏，制约了三孢布拉霉光生物学的发展和类胡萝卜素更高水平的合成。本申请拟就上述问题开展研究，以期为类胡萝卜素合成生物学理论和技术的发展奠定一定基础。1）对三孢布拉霉（-）菌光受体进行鉴定和功能分析；2）基于亚细胞定位分析，光受体和光响应元件结合分析对光受体介导的类胡萝卜素合成机制进行解析；3）基于VVD的光循环效应分析，wc-1、wc-2与vivid基因表达相关性分析以及蛋白相互作用分析对类胡萝卜素合成的“光适应”效应机制进行解析；4）基于CrgA结构域功能分析，wc-1、wc-2和crgA在基因转录和蛋白表达水平相关性分析，CrgA亚细胞定位分析，CrgA与光受体蛋白的相互作用分析对CrgA调控光受体介导类胡萝卜素合成机制进行解析。

三孢布拉霉能大量合成β-胡萝卜素和番茄红素，已用于工业化生产β-胡萝卜素。然而，目前对于光调控三孢布拉霉生物合成类胡萝卜素的研究基本处于空白状态，这一方面限制了三孢布拉霉类胡萝卜素光合成生物学的发展，也制约了在三孢布拉霉中实现类胡萝卜素更高水平的合成。因此，本研究开展了对三孢布拉霉感光系统的挖掘，并解析了其介导类胡萝卜素合成的分子机制。具体包括以下几个方面：1）基于数据库挖掘了三孢布拉霉（-）菌多个光受体（wc-1和wc-2），进行了克隆、测序和生物信息学分析、以及在大肠杆菌中的异源表达和纯化。基于定点突变技术分析了光受体在体外的感光效应以及光循环效应，并基于卷枝毛霉光受体缺失突变株进行了体内功能分析。2）在三孢布拉霉中建立了遗传转化体系和基因编辑体系，包括基因组快速提取方法、基于电转化和农杆菌侵染的遗传转化方法，基于CRISPR/Cas9和Split-marker的基因编辑技术，以及基因干扰技术等，为在三孢布拉霉中进行遗传操作提供了有效的工具。3）研究了光照对三孢布拉霉中类胡萝卜素合成的影响，解析了光照通过诱导ROS以及独立诱导类胡萝卜素合成，并在转录水平和翻译水平等多水平上发挥其作用的调控机制。利用基因干扰技术分析了光受体介导的类胡萝卜素合成作用，对部分调控元件进行了挖掘，并基于EMSA技术对光受体介导类胡萝卜素合成的分子机制进行了解析。4）以三孢布拉霉光受体和类胡萝卜素结构基因（carRA、carB）为对象进行了“光适应”效应的研究，对三孢布拉霉中光适应决定蛋白进行了基因组挖掘。5）进行了crgA基因表达与光照和类胡萝卜素结构基因表达相关性分析研究，利用基因干扰技术分析了crgA介导的类胡萝卜素合成的调控机制。通过异源表达和突变技术，利用泛素化反应对其关键功能域进行了分析。构建了CrgA级联催化反应的所有潜在的重组酶组份，利用体外泛素化反应分析对CrgA调控光受体介导类胡萝卜素合成的潜在分子机制进行了分析。该项目系统挖掘了三孢布拉霉中多个光受体，并利用多种技术手段初步阐明了其介导类胡萝卜素合成信号通道的相关因子及分子机制。