TIRFM-FCS成像系统搭建及其在膜蛋白单分子应用的研究

The dynamic behavior of membrane proteins in living cells in real time non-destructive testing and analysis is an urgent demand for life science research. However, the nano-scale spatial resolution of the membrane and the molecular events microsecond time resolution limited the visualization of the behaviors of these molecules. Thus, a super dimension resolution of the imaging techniques need to be developed to investigate the relative independent and early events of life activities in the single-molecule levels. Based on our earlier investigations, considered to the technical insufficiency to study membrane porteins dynamics in living cells, we will develop a real-time and high-resolution fluorescence quantitative analysis system. Applying this TIRFM-FCS platform, we will carry out experiments to study the lateral movement, oligomerization, and endocytosis of plant membrane G protein-coupled receptor GTG1 and GTG2, to clarify the membrane protein early response to environmental stimuli in space-time dynamics and their visualization. The present project will expand the single-molecule detection technology associated with the key techniques for investigating the activity of membrane proteins and their regulations in this important biological process.

在生物活细胞中，膜蛋白分子动态行为的实时无损检测与分析，是生命科学研究中迫切需要解决的问题。然而细胞膜的纳米尺度结构及其分子事件的微秒级时间分辨率，却限制了对其分子行为的可视化追踪成像。为此有必要发展超时空分辨率的成像技术,从而在单分子尺度上探测细胞生命活动的单个、相对独立的早期事件。本项目拟在我们过去研究工作的基础上，进一步创研出一种基于全内反射荧光显微术（TIRFM）和荧光相关光谱（FCS）相结合的实时高分辨率荧光成像与定量分析技术。并以植物细胞膜上G蛋白偶联受体GTG1、GTG2为研究对象，对它们的侧向运动、寡聚化和内吞进行活体动态进行分析。以实现植物细胞膜蛋白对环境刺激响应早期事件中时空动态分析及可视化成像，旨在拓展单分子检测技术的综合联用，从而为膜蛋白活性调节这一重要生物学问题的研究提供关键的技术手段。

在生物活细胞中，膜蛋白分子动态行为的实时无损检测与分析，是生命科学研究中迫切需要解决的问题。然而细胞膜的纳米尺度结构及其分子事件的微秒级时间分辨率，却限制了对其分子行为的可视化追踪成像。为此有必要发展超时空分辨率的成像技术,从而在单分子尺度上探测细胞生命活动的单个、相对独立的早期事件。本项目在我们过去研究工作的基础上，进一步创研出一种基于全内反射荧光显微术（TIRFM）和荧光相关光谱（FCS）相结合的实时高分辨率荧光成像与定量分析技术。并以植物细胞膜上G蛋白偶联受体GTG1、GTG2为研究对象，对它们的侧向运动、寡聚化和内吞进行活体动态进行分析。实现了植物细胞膜蛋白对环境刺激响应早期事件中时空动态分析及可视化成像。针对多假设追踪（MHT）算法在多目标关联跟踪过程中计算量大的问题，提出了一种改进的多假设跟踪算法。单颗粒追踪（single particle tracking）中的轨迹预测是用一个标准的Kalman滤波模型来估值和预测，并结合植物细胞荧光成像的特点，用MATLAB实现了算法，并简化了运算、提高了运算速度，在实践中取得了良好的应用效果，将单个膜蛋白运动参数的分析精度推进到纳米和毫秒级。我们的研究成果，为进一步揭示植物细胞膜蛋白通过不同聚合方式和侧向运动实现自我活性调节的机制奠定了基础。