单分子仿生界面的构建及其在成像分析中的应用研究

This project is proposed to fabricate bionic interfaces for single-molecular analysis and further apply to imaging assays by combining total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) with biological nanochannels, optical tweezers, and micro-nano fabrication technologies. The main research work includes the following aspects. (1) Fabrication of bionic interfaces for single-molecular analysis based on α-hemolysin nanochannels by taking the advantage of easy modification of nucleic acids. By means of tool enzyme-assisted signal amplification or expression of green fluorescence protein (GFP), it is expected to achieve optical microscopic imaging assay at single-molecular level. (2) Fabrication of single-molecular bionic interfaces by combining optical tweezers with TIRF, which could achieve imaging analysis of polymerization-nicking processes of nucleic acids at single-molecular level. (3) Fabrication of bionic interfaces using microbeads in microarrays as anchor points and observation markers, which are further applied to investigate the interaction and migration of proteins on nucleic acids by using nucleic acid strands as “migration track”, achieving high throughput TIRF detection of single molecular between proteins and nucleic acids. (4) Investigation of the dynamic, mechanism and performance of targets in tumor cells by using SERS and micro-nano fabrication technologies, achieving pathogenesis study of cancers.

本项目将全内反射荧光显微镜技术、表面增强拉曼光谱技术与生物纳米通道分析技术、光镊技术和微纳加工技术相结合，拟开展单分子仿生界面的构建及其在成像分析中的应用研究。主要研究工作包括以下几个方面：（1）以α-溶血素纳米通道为基础， 结合核酸易于修饰的特点，构建单分子仿生界面，通过工具酶的信号放大作用或者绿色荧光蛋白的表达，实现核酸的单分子光学显微成像分析；（2）将光镊与全内反射技术相结合，通过单分子仿生界面的构建，实现单分子水平上的核酸聚合、剪切成像分析；（3）以微米孔阵列中的微珠为固定点和观察标记，构建单分子仿生界面，考察以核酸链为“轨道”的迁移性的蛋白质与核酸链的作用及其迁移行为，从而实现蛋白质与核酸作用的高通量单分子全内反射荧光检测；（4）将表面增强拉曼成像技术与微纳加工技术相结合，在单细胞水平上探索肿瘤细胞内靶标的动态、作用机理和表现，以期实现癌症的致病机理研究。

面向医养健康领域，针对癌症诊疗技术难题，本项目构建了具有良好可控性和稳定性的新型单分子仿生界面，结合信号放大策略或蛋白质表达系统，建立了单分子检测新技术；发展了细胞内相关生物分子事件动态成像示踪新方法，为解决生命科学中的重大问题提供理论依据。在检测方面，构建仿生分子识别探针，发展酶循环等信号放大技术，提高检测灵敏度，对蛋白标志物的检测限达到fM水平；对DNA、miRNA的检测限达到aM水平；可直接检测单个肿瘤细胞。在成像方面，通过激光共聚焦成像、拉曼光谱成像等手段，实现了单个肿瘤细胞表面糖基、受体和细胞内标志物的成像分析。在诊疗一体化方面，通过研制靶向药物载体及活体成像分析，将诊断和治疗两个功能集成于同一载体上，构建肿瘤诊疗一体化平台，提高靶向性，减少治疗副作用。该项目围绕肿瘤诊疗的几个重要科学问题的研究取得预期成果，研究工作完成预期计划。相关研究成果发表在Chem. Soc. Rev.、Nat. Protoc.、Adv. Funct. Mater.、Chem. Sci.、Anal. Chem.等国际重要学术期刊。发表高水平学术论文50余篇，包含ESI高被引论文1篇，热点论文2篇，期刊VIP论文1篇；出版专著1部，授权发明专利9项，获省级自然科学二等奖一项。