嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶的结构功能及其适热性的分子机制

生物体的生存依赖于体内蛋白质的正确折叠。嗜热古菌生活在极端高温环境，研究其蛋白质在高温环境下正确折叠的分子机制具有重要意义。申请人前期的工作表明，嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶(mtPDI)的表达受温度的调控，且mtPDI可以提高细胞的热耐受性，但其分子机制尚不清楚。本项目将从mtPDI操纵子结构解析着手，通过分析操纵子结构基因和免疫共沉淀获得mtPDI功能相关基因，构建mtPDI蛋白质突变体解析其蛋白质结构域，抑制mtPDI酶活性以分析mtPDI功能缺失对细胞的影响，分析不同温度下mtPDI及其功能相关蛋白质的细胞内的定位、表达特征、及功能相关蛋白对mtPDI酶活的影响，分析mtPDI及功能相关蛋白协同表达与大肠杆菌的热耐受性之间的关系，以期阐明mtPDI在二硫键形成和细胞适热的机制。本研究将有助于阐明嗜热古菌适热生存的分子机制。

生物体的生存依赖于体内蛋白质的正确折叠。嗜热古菌生活在极端高温环境，研究其蛋白质在高温环境下正确折叠的分子机制具有重要意义。申请人前期的工作表明，嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶(mtPDI)的表达受温度的调控，且mtPDI可以提高细胞的热耐受性，但其分子机制尚不清楚。本项目通过RT-PCR分析确定了 mtPDI的ORF组成，结果表明mtPDI操纵子中ORF只由mtPDI组成，mtPDI（MTH1745）、MTH1744 和MTH1746分别会转录成mRNA, 但不与mtPDI在同一个操纵子中。构建mtPDI关键结构域中“CXXC”的两个半胱氨酸的单点突变和双点突变(C74S,C77S,C74S-C77S)，发现点突变任何一个半胱氨酸都将影响mtPDI的二硫键异构酶活性。接下来，我们分析mtPDI的细胞定位，实验表明mtPDI主要分布在细胞膜上。高温和冷刺激都会提高mtPDI mRNA的含量。但不同于mRNA水平，蛋白质水平调控与此不同，高温（70℃）可诱导mtPDI蛋白质表达量增高，冷激对mtPDI蛋白质表达量变化影响不显著。可能温度胁迫下，高温和冷激对mtPDI的表达调控作用机制不一样。分别用PDI抑制剂DNTB或mtPDI单克隆抗体抑制细胞膜上的PDI，DTNB会明显抑制细胞的生长，扫描电镜观察到mtPDI单克隆抗体的加入会影响细胞膜的结构，在细胞膜上形成更致密的凸起状结构，其机制还不清楚。我们分析了mtPDI与水稻的耐热性之间的关系，成功构建了mtPDI转基因水稻，证明mtPDI能够帮助水稻耐高温。为了进一步深入研究PDI在细胞中的功能，我们采用CO-IP方法找到一些具有意义的候选相互作用蛋白质，这将为研究mtPDI互作蛋白其功能奠定了基础。同时我们用iTRAQ得到大量与嗜热自养甲烷杆菌高温和冷激胁迫下差异表达的蛋白质，从蛋白质组水平分析不同温度胁迫下，甲烷菌将采用怎样的pathway应对外界胁迫的。本研究得到大量有意义的结果，将有助于阐明嗜热古菌适热生存的分子机制。