DNA四面体的细胞摄取，转运及其机制研究

Self-assembled DNA nanostructures have emerged as a type of nano-biomaterials with precise structures, versatile functions and numerous applications, such as drug delivery. The study of the cellular uptake and transport process of DNA nanostructure are of great significance for its application in the field of biological and medicine. DNA tetrahedron is a great model of DNA nanostructure since it can be easily synthesis with different size and biologically modify. In this project, we want develop and use multiple cell image tools, such as super resolution microscopy, total internal reflection microscopy, live cell imaging technology to study the cell uptake, transport, localization and discharge process of DNA tetrahedron. We also want to explore the related mechanism of these biological processes. Base on the analysis of the relationship between the size, modification of DNA tetrahedron and their interaction of cell, we want to develop the reliable method to control the fate of DNA tetrahedron in the cell, which can be helpful to strengthen its biological function. This project could deepen the understanding of the cellular mechanisms of how the nucleic acids uptake by the cell. On the other hand, this project would also be very helpful to the biological applications of DNA nanostructures such as drug delivery and gene regulation.

DNA纳米技术是目前纳米领域一个新兴的研究热点，其细胞摄取、转运过程的研究对其在生物医药领域的应用具有重要意义。本项目拟以DNA四面体作为研究对象，使用包括超分辨细胞成像技术、全内反射显微技术、活细胞成像技术等成像手段，系统研究不同尺寸大小、偶联不同生物分子的DNA四面体的细胞摄取、转运、定位及外排的过程，并探索其相关机制。在此基础上，还拟通过修饰特定生物功能化片段改变DNA四面体的细胞摄取方式及细胞器定位，并强化其生物学功能。本项目的实施不但能够加深对核酸类物质进入细胞机制的理解，也能为利用DNA纳米结构进行药物运输、基因调控等生物学应用奠定基础。

本项目主要研究成果阐述如下。.（一）利用色谱法批量高效纯化分离DNA四面体及其复合物.我们首次将阴离子交换色谱（AEC）和体积排阻色谱（SEC）方法用于DNA四面体及其聚合物以及三角双锥的纯化, 利用AEC将这些DNA纳米结构从初始合成纯度30%~65%提高到95%左右。利用SEC分离纯化DNA四面体二聚体和三聚体，分别把初始合成纯度14%提高到98%和12%提高到95%。与电泳割胶回收相比, 利用色谱分离纯化的方法对结构无破坏、操作简单、回收率高、短时间内即可纯化出大量样品。该方法解决了大规模、高纯度DNA四面体的制备难题,对于DNA纳米结构未来作为载体或者免疫佐剂等在生物学和医学领域广泛应用有着重要意义。.（二）DNA四面体的细胞摄取及体内转运研究.利用成像技术，我们详细研究了DNA四面体在体内的安全性及稳定性。在此基础上，我们进一步研究了其体内转运行为。通过在四面体上和伸出的手臂链上标记荧光或者放射性同位素，然后注射到小鼠体内，实现近红外荧光NIRF和单光子发射体层摄影SPECT两种不同模式的成像。发现手臂链有利于四面体稳定，可在血清中存在12h以上。在NIRF中发现四面体和双链DNA在小鼠体内的药代动力学不同，体内的生物分布区别明显。还注意到四面体在血液系统中循环中期是双链两倍。通过在四面体手臂链上修饰肿瘤靶向的叶酸、NIR emitter Dylight 755和放射性同位素 99mTc，可实现靶向癌细胞的双重模式（NIR＋SPECT）成像。.（三）一种新的DNA结构偶联技术.基于DNA折纸结构，我们研究了其与作为模型的纳米粒子的不同偶联技术，并发展出类似“复印”原理的纳米粒子表面修饰技术，使多种不同分子通过DNA固定在纳米粒子表面排列成特定图案。使用这些DNA偶联后的纳米粒子，可进一步调控其高级组装过程，获得尺寸、形状、手性等均可精确控制的四面体结构。