ABC转运器ZnuEFGH介导铜绿假单胞菌锌离子摄取的分子机制研究

Zinc is an essential trace element for almost all living organisms. In the opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa, zinc has been shown to play an important role in virulence, in colonization of the host organism and has also been shown to be involved in antibiotic resistance. Although P. aeruginosa is known to possess three zinc uptake systems (ZnuABC, HmtA and CntIMLO) enabling it to thrive in zinc-depleted conditions, the ΔznuBCΔcntLΔhmtA strain is capable of acquiring sufficient Zn2+ to maintain normal growth under zinc-deficient conditions. Hence, it is likely that P. aeruginosa possesses one or more additional Zn2+ acquisition mechanisms to ensure the cellular Zn2+ requirement is met. And, a putative ABC transporter gene cluster znuEFGH could possibly be involved in Zn2+ uptake. Our previous research and preliminary data have led to a hypothetical model in which the mechanism of Zn2+ transport across the cytoplasmic membrane mediated by ZnuEFGH in P. aeruginosa is proposed. This project aims to verify and complete this hypothetical model from the aspect of the regulation, ion transport and structural organization of ZnuEFGH by using transcriptional lacZ fusions, real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), electrophoretic mobility shift assay (EMSA), inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS), isothermal titration calorimetry (ITC), protein-protein interactions and site-specific mutagenesis. Through the implementation of this project, we will dissect the mechanism of Zn2+ acquisition mediated by ZnuEFGH that may lead to a major breakthrough for the research of zinc uptake, and provide important guidance to prevent and treat the infection caused by P. aeruginosa.

锌几乎是所有生命体所必需的微量元素，同时它也在铜绿假单胞菌的致病和抗生素耐药方面起重要作用。虽然ZnuABC、HmtA和CntIMLO是目前已知铜绿假单胞菌的三套锌离子摄取系统，但是同时缺失这三套锌离子摄取系统该细菌仍然能够在限锌培养基中有效生长。因此，在铜绿假单胞菌中可能还存在其他未被鉴定的锌离子摄取系统，编码ABC转运器的znuEFGH操纵子可能就是其中之一。基于前期的预实验数据，我们提出了ZnuEFGH介导铜绿假单胞菌锌离子摄取的分子机制假设模型。本项目拟利用lacZ转录融合、RT-PCR、EMSA、ICP-MS、ITC、蛋白互作和定点突变等技术，从ZnuEFGH的调控、离子转运和组织结构等方面对该假设模型进行验证和完善，以揭示铜绿假单胞菌利用ZnuEFGH介导锌离子摄取的分子机制，从而为铜绿假单胞菌锌离子摄取系统的研究带来更深入的进展，对预防和治疗由该菌引起的感染具有重要指导意义。

锌几乎是所有生命体所必需的微量元素，同时它也在铜绿假单胞菌的致病和抗生素耐药方面起重要作用。虽然ZnuABC和HmtA是目前已知铜绿假单胞菌的锌离子摄取系统，但是同时缺失这些锌离子摄取系统该细菌仍然能够在限锌培养基中有效生长。因此，在铜绿假单胞菌中可能还存在其他未被鉴定的锌离子摄取系统。通过本项目的实施，我们综合利用基因敲除、遗传互补、生长曲线分析、EMSA、ICP-MS、PAR实验、lacZ转录融合、细菌双杂交和大蜡螟感染分析等手段在铜绿假单胞菌中鉴定了一个新的锌离子摄取系统，该系统由cntRLMN和cntABCD（也称znuEFGH）这两个操纵子组成，它们均受Zur蛋白的直接负调控并通过合成锌载体Pseudopaline（PDP）来介导锌离子的摄取，是铜绿假单胞菌毒力所必需的。基于现有数据我们提出了PDP介导铜绿假单胞菌锌离子摄取的分子机制建议模型，即：CntL和CntM负责催化合成PDP，胞内的PDP经CntN被转运至周质空间并交予CntD，通过CntD-PDP与MexB的互作，PDP进一步通过MexAB-OprM外排泵被释放到胞外。在胞外，PDP与游离的Zn2+结合形成PDP-Zn2+复合物，该复合物通过外膜受体CntR进入周质空间。进入周质空间的PDP-Zn2+复合物与CntA结合，该结合使CntA的构象发生改变，导致CntA可与CntC互作，并将Zn2+交给CntC转运进入胞内，该过程由CntB水解ATP提供能量。同时，CntD接收来自CntC上释放Zn2+后的PDP，形成CntD-PDP复合体，再通过与MexAB-OprM外排泵的MexB互作，PDP经该外排泵被分泌到胞外循环使用。总之，通过该项目的实施我们在铜绿假单胞菌中发现了一个由CntRLMN-CntABCD/PDP介导的新的锌离子摄取系统，为靶向金属离子摄取系统的新型抗铜绿假单胞菌药物的开发奠定基础。