新的具有转糖基活性的唾液酸苷酶的基因发掘、分子改造及其催化分子机制研究

More than one available reactive hydroxyl group of carbohydrates makes chemical synthesis laborious and difficult for application. The glycosidase approach in enzymatic synthesis has better industrial practicality as the simple glycosyl donors and diverse acceptors are used. Sialoglycans with sialic acid occupation of outermost positions are widespread in higher animal cell surface have a variety of important biological functions, such as cell-cell interactions, immune response, pathogen adhesion and so on. More than 70% of human milk oligosaccharides are sialyloligosaccharides which play important roles in gut maturation, brain and cognitive development and supporting resistance to pathogen infection in neonate. We have unearthed a new sialidase from CAZy Database and synthesized 6'-sialyllactose at the highest conversion reported so far. This project intends to discover more new transglycosyl-sialidase from CAZy Database. We will make use of molecular evolution to improve trans-glycosylation activity and regioselectivity of the enzymes, and to expand their substrate specificity. Moreover, we will elucidate the molecular mechanism of effects of specific amino acid sites on trans-glycosylation activity, substrate specificity and regioselectivity. The research will be able to provide a variety of new powerful enzymatic tools for the synthesis of sialoglycans/ sialyloligosaccharides and sialyl-chemicals and the interpretation of the specific amino acid sites affecting transglycosylation, substrate specificity and regioselectivity, which will deepen the understanding of the mechanism of glycosidase transglycosylation and promote the practice of glucosidase synthesis of glygan.

糖的多羟基使特异糖苷的化学法合成步骤繁琐；糖苷酶法糖基供体为简单糖类且糖基受体多样，应用潜力巨大。唾液酸末端定位的唾液酸糖链普遍存在于高等生物细胞表面，具有细胞间相互作用、免疫反应、病原体粘附等重要功能；人乳寡糖的70%以上是唾液酸寡糖，在婴幼儿肠道菌群形成、大脑发育及抵抗病原体感染中具有重要作用。我们已从糖酶数据库CAZy Database发掘出了一种新的唾液酸苷酶，以目前报道的最高转化率专一合成了6’-唾液酸基乳糖。本项目拟从该数据库中继续发掘出更多新的转糖基唾液酸苷酶，分子改造提高酶的转糖基活性和区域选择性，拓展酶的底物特异性，并阐释特殊氨基酸位点影响转糖基活性、区域选择性及底物特异性的分子机制。项目完成不仅可获得多种新的糖合成工具酶用于唾液酸糖链和糖苷化合物的合成，而且所阐释的糖苷酶转糖基作用相关的分子机制，也将加深人们对糖苷酶转糖基性质的理解，促进糖苷酶法合成糖苷的研究及应用。

唾液酸常存在于各种真核生物糖蛋白、鞘糖脂等糖链的末端，由于唾液酸末端定位和负电荷特性，唾液酸糖链具有重要的生物功能，包括细胞间的相互作用、免疫反应、细菌粘附和病毒感染等。利用微生物来源的唾液酸苷酶和锥虫来源的转唾液酸苷酶合成唾液酸糖链/寡糖已经成为了一个非常有吸引力的酶合成方法。但是目前研究报道的细菌或病毒源唾液酸苷酶的合成产率比较低（0.3-24%），而且产物常为α-2,3键和α-2,6键唾液酸苷的同分异构体混合物，分离纯化比较困难；而锥虫源转唾液酸苷酶具有比较高的转糖基活性，但该类酶只能合成α-2,3键唾液酸苷，不能合成α-2,6键唾液酸苷。这些局限导致了目前仅有很少一部分商品化的酶被用于研究，远远不能满足酶法大量合成获得各种特定结构的唾液酸糖链/寡糖及唾液酸苷化合物的需求，限制了新的相关糖类药物研发和人乳寡糖的工业化制备和应用。在本项目工作中，我们发现了新的来源于肠道细菌的唾液酸苷酶，发展了一种有效的分子改造策略，获得了一系列具有应用前景的具有高的转糖基活性的突变酶。以肠道菌群的宏基因组为模板克隆并表达得到了8种GH33家族的具有转糖基活性的唾液酸苷酶，系统地研究了一种来源于Bacteroides intestinalis的转糖基活性较高的唾液酸苷酶BiS47的底物特异性、酶水解唾液酸二糖、6’-唾液酸乳糖和3’-唾液酸乳糖的动力学参数和转糖基反应条件；深入开展了BiS47的理性设计分子改造，成功获得了转糖基活性显著提高的突变体BiS47-G185C和BiS47-G398H，并将所发现的G185C和G398H位点突变策略应用到本研究发掘获得的4种同属不同种细菌源唾液酸苷酶的分子改造中，进一步获得了一系列转糖基催化活性提高的突变酶。本项目工作为酶分子改造的理性设计奠定了理论基础，对于新的糖合成工具酶开发、酶法合成唾液酸糖链/寡糖及唾液酸苷化合物，以及在此基础上进一步开发药物和母乳寡糖等，具有重要的科学意义和应用价值。