分子改造Levan蔗糖酶拓展转糖基底物特异性研究

结构多样的寡糖库是糖基化修饰和糖链探针研究的基础。糖的多个羟基使特异糖苷合成的化学法步骤繁琐，应用难度大。生物酶法中的糖苷酶法糖基供体为简单糖类且糖基受体多样，工业实用性较好。Levan蔗糖酶能以蔗糖为底物转果糖基合成β-2,6果糖苷键组成的Levan类寡糖和聚糖。微生物来源的Levan蔗糖酶合成寡糖和聚糖的比例不同，表现出底物特异性差异，该特性是由酶分子中的某些氨基酸决定的。我们已经筛选到一株高产Levan聚糖的地衣芽胞杆菌，本项目进行该菌株Levan蔗糖酶的分离纯化和转糖基研究，酶基因克隆后序列分析推测酶分子中与转糖基反应的底物特异性可能有关的氨基酸，定点饱和突变建立突变酶库，筛选获得转糖基底物特异性拓展的突变酶。本项目完成不仅可填补国际上地衣芽胞杆菌Levan蔗糖酶系统研究的空白，而且转糖基底物特异性拓展的突变酶可作为酶法合成寡糖或糖苷化合物的有力工具，推进糖基化工程和糖药物的研发。

Levan蔗糖酶能以蔗糖为底物转果糖基合成β-2,6果糖苷键连接的果寡糖和果聚糖。微生物来源的Levan蔗糖酶合成寡糖和聚糖的比例不同，表现出底物特异性差异。本项目分离纯化了地衣芽孢杆菌8-37-0-1的Levan蔗糖酶，分子量约为50kDa，N-端氨基酸序列为KETQDYKKSY。该酶在0.8M的蔗糖溶液（pH 6.5）中，40℃反应24h，合成的Levan果聚糖分子量为2千万，反应48h后，Levan果聚糖的分子量稳定在4 百万。PCR扩增得到8-37-0-1菌株的Levan蔗糖酶基因sacB（GenBank No. KF647836），为1446bp，编码482个氨基酸，理论分子量为53.7kDa，第30-39个氨基酸序列完全对应于纯化获得的天然Levan蔗糖酶N-端氨基酸序列。分别将sacB和sacB-30在大肠杆菌中重组表达，表达sacB的重组菌培养液上清和细胞中均有酶活，而表达sacB-30的重组菌培养液上清没有酶活，细胞内有酶活。重组酶分别经镍亲和纯化，SDS-PAGE结果显示重组SacB-30蛋白为单一带（58kDa），重组SacB蛋白为两条带（51kDa和60kDa），蛋白肽指纹图分析结果均为Levan蔗糖酶。与天然酶相同条件下反应24h，重组SacB-30合成的Levan果聚糖分子量为1千万，反应48h后，果聚糖分子量与天然酶相同，反应中还生成少量果寡糖，鉴定其中三糖为新蔗果三糖（neokestose）和1-蔗果三糖（1-kestose）。重组酶具有广泛的糖基受体底物特异性，能以多种单糖、寡糖、糖醇、多种酚类及短链烷基醇类化合物为糖基受体合成果糖苷。分离获得了4种转糖基产物，果糖基分别以β(2,1)连接到糖受体上，显示出该酶以其他单糖和寡糖为转糖基受体合成果糖苷时具有显著不同于合成Levan果聚糖时的优选β(2,6)区域选择性。生物信息分析推测了Levan蔗糖酶与转糖基反应底物特异性可能有关的氨基酸位点，定点突变筛选获得的六种突变酶都丧失或降低了合成果聚糖的能力，均合成3-8不同聚合度的果寡糖，纯化了9种3-8聚合度寡糖，结构解析发现所有突变酶均改变了糖合成的聚合度，但不改变原始酶合成果聚糖时优势的β(2,6)区域选择性。