分子改造β-半乳糖苷酶拓宽转糖基受体选择性

β-半乳糖苷酶是一类重要的糖苷酶，能对多种受体分子糖环或烷基上的羟基进行糖基化，合成具有重要价值的半乳糖苷化合物，但该类酶不能糖基化芳香环羟基，转糖基受体种类存在一定局限，限制了其合成糖苷的种类及其在某些药物修饰等方面的应用。本项目通过蛋白质理性设计和非理性设计分子改造β-半乳糖苷酶，拓宽转糖基受体选择性，拓展酶的应用范围。拟采用生物信息学方法预测酶与受体选择性相关的氨基酸位点，验证推测结果，确定关键位点；在关键位点采用PCR进行点饱和突变，同时对酶基因采用易错PCR和连续易错PCR进行随机突变，以简单酚类为受体快速筛选并获得受体选择性拓宽的突变酶；应用突变酶糖基化重要化合物的芳香环羟基获得糖苷新产物，如糖基化修饰酚类化合物及杂环类药物分子如链黑霉素等。本项目将填补国际上糖苷酶与受体选择性相关位点研究及分子改造糖苷酶拓宽受体选择性的空白，并推进糖苷库、糖基化工程和糖药物的研究与产品开发。

本项目按计划完成预计目标：确定了保加利亚乳杆菌L3β-半乳糖苷酶与受体选择性相关的关键氨基酸位点；获得了2种受体选择性拓宽的突变酶；用突变酶修饰重要化合物的芳香环羟基、获得了5种以上糖苷新产物；发表了2篇SCI论文（Food Chem, 2012, 134: 269-275；Bioresource Technol, 2012, 116:327-333）；超额申请了6项国家发明专利（专利申请号：201310256401.9, 201310255797.5, 201310257383.6, 201310257340.8, 201310256580.6, 201310257432.6）。. 预测并验证了β-半乳糖苷酶与底物特异性相关的氨基酸位点——W980位点，在该位点进行点饱和突变研究，所得19种突变酶对人工底物邻硝基苯半乳糖苷的水解活性降低。以19种突变酶粗细胞酶液为酶源，以乳糖为底物进行自转糖基反应，结果显示所有突变酶对乳糖的水解及自转糖基的活性均降低，然而，当以乳糖为糖基供体、以对苯二酚为糖基受体时，突变酶W980F对对苯二酚的转糖基产物产量明显提高。进一步纯化获得W980F突变酶纯酶，该纯化酶对邻硝基苯半乳糖苷的Km值相比于原始酶降低，对乳糖的Km值增加，其他酶学性质与原始酶基本一致。突变酶对醇羟基受体的转糖基性质与原始酶基本一致，但对酚羟基受体的转糖基能力较原始酶显著提高。. 同时采用易错PCR对原始酶进行随机突变，通过X-Gal平板初筛及转糖基反应TLC复筛获得一株突变酶252具有新的转苷受体选择性，能对白藜芦醇进行糖基化。对该突变酶基因进行测序和序列分析，结果表明该突变酶6个氨基酸位点发生突变，分别为Q40R、K85R、F117S、D433G、V511A、E707G，选择以上6个氨基酸位点进行单点突变，结果表明117、511、707位的单点突变也能使该酶获得对白藜芦醇的转苷能力，这些位点也与该酶的转糖基受体选择性相关。. 应用上述两种突变酶以苯酚、邻苯二酚、间苯三酚、咖啡酸、白藜芦醇为受体进行转糖基反应，所获得的转糖基产物经制备TLC及Bio-gel P2柱层析分离纯化后，采用质谱分析分子量，然后通过一维和二维核磁共振（氢谱、碳谱、HSQC，HMBC）确定为新的半乳糖苷产物，顺利完成了本项目的预期目标。