CRISPR靶向调控HDAC9在骨髓基质干细胞治疗股骨头坏死的作用

With multi-differentiation potential, marrow stromal cells(MSCs) is considered as the cruical factor in the pathogenesis and the key treatment target of the femoral head necrosis. Autologous transplantation of MSCs show significantly decreased osteogenic differentiation potential vessels,thus restricts its clinical efficacy of the treatment of osteonecrosis. Recent studies have demonstrated that HDAC9 is not only the key regulator of osteogenic and fat differentiation, but also an important modulator of angiogenesis. Angiogenic-osteogenic coupling is considered as the difficulty process of MSCs differentiation. Therefore，regulation of HDAC9 for MSCs is expected to be a breakthrough of the femoral head necrosis treatment. The latest research shows that gene editing technology CRISPR can accurately guide, target and modulate gene expression.We have already established the model of femoral head necrosis and mastered the CRISPR technology in bone tumors. Based on these, we plan to regulate HDAC9 bidirectionally and repair the MSCs defects of angiogenic-osteogenic coupling, then verify the efficacy MSCs transplantation therapy. The purpose of this study is to further reveal the mechanism of HDAC9 in femoral head necrosis and provide a theoretical basis for new therapeutic strategies.

多向分化潜能的骨髓基质干细胞（MSCs）被认为是股骨头坏死发病机制的中心环节及治疗的关键靶点。股骨头坏死的自体MSCs成骨成血管分化潜能显著下降，制约其治疗骨坏死的临床疗效。新近研究表明HDAC9不仅是开启MSCs成骨成脂肪分化调节关键因素，还具有靶向调节成血管的重要功能。成骨偶联成血管过程一直被认为是调控MSCs分化的难点，因此HDAC9对MSCs成骨偶联成血管调控有望成为股骨头坏死防治研究新的突破点。最新的基因编辑技术CRISPR能精确制导靶基因的定点敲除和靶向修饰。本研究拟通过已建立的激素性股骨头坏死模型，利用已掌握的CRISPR技术定点敲除和靶向激活修饰系统定位双向调控HDAC9，以期修复MSCs成骨偶联成血管的分化缺陷，并验证修饰后MSCs移植治疗骨坏死的疗效，从而深入探讨HDAC9在股骨头坏死中的作用机制，为防治股骨头坏死提供理论基础和新的治疗策略。

本研究拟探讨激素性股骨头坏死的发病机制，通过已掌握的CRISPR技术靶向敲除HDAC9并利用慢病毒感染MSCs，观察HDAC9下调后对骨髓间充质干细胞成骨偶联成血管分化的影响。我们收集了激素性与非激素性股骨头坏死来源患者的股骨近端骨髓，成功培养出了MSCs，利用RT-PCR分别检测两组来源MSCs的HDAC9其mRNA表达。我们利用CRISPR技术靶向敲除HDAC9，并利用慢病毒作为载体成功感染MSCs，采用RT-PCR及Western Blot技术检测HDAC9含量，验证是否下调成功。我们采用MTT检测其增殖能力、采用流式细胞学检测其凋亡功能；我们对敲除HDAC9的MSCs分别进行成骨、成血管、成脂肪诱导分化培养，采用茜素红染色、血管形成实验以及油红O染色观察其分化能力，也通过RT-PCR及Western Blot检测成骨相关基因Runx2、OCN，成血管相关基因PDGF-BB、CD31，成脂肪相关基因PPARγ的表达。同时，为了进一步探究HDAC9通过何种方式影响MSCs成血管分化，我们也采用RT-PCR检测了miR17-92簇表达水平变化。最后，为了探究HDAC9基因下调对相关基因表达的影响，我们采用Affymetrix表达谱芯片进行相关检测，并利用生物信息学的方法进行功能富集分析。此外，我们还成功构建兔激素性股骨头坏死的模型，并将HDAC9的CRISPR激活系统修饰MSCs，通过骨髓回输移植。结果显示SONFH来源的MSCs 其HDAC9的表达显著降低。利用CRISPR技术靶向敲除HDAC9并通过慢病毒感染MSCs后，HDAC9的表达显著降低，表明我们成功构建HDAC9下调的MSCs。MTT检测及流式细胞学分析结果提示HDAC9敲低后不会影响MSCs的增殖与凋亡。HDAC9敲低将会导致MSCs的成骨偶联成血管分化能力降低，成脂分化能力增强。另外，HDAC9敲低后可使hsa-miR-17-5p、hsa-mir-92-1表达显著升高，hsa-miR-20a、hsa-miR-19b-1表达降低。Affymetrix表达谱芯片检测提示HDAC9下调后，共有2557基因表达发生改变。生物信息学分析发现HDAC9下调后差异基因主要参与DNA复制、核小体装配、组蛋白偶联以及NOD-like receptor、TNF信号通路。动物模型提示骨髓回输移植治疗效果不佳。本研究利用