Alcaligenes faecalis strain NR 异养脱氮途径及其酶调控机制

Conventional biological nitrogen removal consists of two steps: nitrification by autorophs under aerobic conditions and denitrification by heterotrophs under anaerobic conditions. However, some heterotrophic microorganisms could complete the whole biological nitrogen removal process only under aerobic conditions. Moreover, a possible biological nitrogen removal pathway of NH4+→NH2OH→N2O→N2 might exist in heterotrophic microorganisms, but there is a lack of enough evidences for this metabolic pathway. In this study, a heterotrophic microorganism of A. faecalis strain NR is aimed to investigate. Based on 15N isotope technology, key enzyme assay, gene sequencing and chemical analysis, the metabolic pathway will be demonstrated and the affecting factors of heterotrophic nitrogen removal will be optimized. Furthermore, the mechanism for this pathway will be explored. This study is of great significance to understand the heterotrophic nitrogen removal capability and its metabolic mechanism, and also provide necessary knowledge to construct nitrogen removal engineering strains and develop novel nitrogen removal technology.

经典的生物脱氮是基于自养菌和异养菌分别在好氧和缺（厌）氧条件下的硝化和反硝化作用序批进行的。但已有研究证实在完全好氧条件下某些异养细菌能独立完成整个生物脱氮过程。对此，可能存在NH4+→NH2OH→N2O→N2这一新的脱氮代谢途径。但上述途径目前尚缺乏足够的科学与实验证据。本项目以申请人已经分离获得的异养菌A. faecalis strain NR为研究对象，拟采用同位素示踪、关键酶分离纯化、编码基因测序和化学计量学原理，通过对其异养脱氮性能、物质代谢途径、关键功能酶及其编码基因的研究，确认其异养脱氮的途径，优化影响其脱氮性能的工艺因素，初步揭示这一脱氮途径产生的根源与调控机制，为深入了解异养菌的脱氮性能、丰富和发展生物脱氮理论提供知识积累，为构建高效生物脱氮工程菌进而开发新型生物脱氮技术提供理论依据。

本项目以已分离获得的异养菌A. faecalis strain NR 为研究对象，考察该菌株异养脱氮性能以及影响其脱氮性能的因素；通过物质代谢途径分析和15N示踪技术探明其异养脱氮途径；通过对调控这一脱氮过程的关键酶及其编码基因的研究初步揭示这一脱氮途径产生的根源。得到的结论如下：从非自养性、异养性、好氧性、脱氮性、氮平衡等多方证明了 A. faecalis strain NR具有异养脱氮能力。适宜的脱氮条件为柠檬酸三钠为碳源，摇床转速121.3 rpm，温度29.5 °C，pH 7.2，C/N 9.6，Mg2+对菌株NR脱氮的贡献最大，Zn2+次之。物质代谢途径分析和15N示踪表明A. faecalis strain NR仍然存在着与传统脱氮途径相似的氮代谢途径，即NH4+-N → NH2OH → NO2--N →NO3--N和NO3--N → NO2--N → N2O → N2。此外，A. faecalis strain NR还存在着一条新的代谢途径，即NH4+-N → NH2OH → N2O → N2。通过对脱氮过程中的关键酶（HAO，Nar和Nir）酶活性及其代谢产物的检测，从酶学角度进一步证明了上述两条脱氮途径的存在。在氮代谢过程中HAO起着将羟胺氧化成亚硝酸盐和氧化亚氮的双重作用。HAO的酶活性在温度为30℃和pH为8时最大，Ca2+对HAO活性有明显的提升，Mn2+的加入使得HAO活性下降。DEAE Cartridge柱纯化表明，HAO可能有两个亚基，其大小在50 kDa 和25 kDa。通过PCR获取菌株NR的Nir序列，结果表明菌株NR的Nir与铜离子结合型亚硝酸盐还原酶（NirK）相似度极高。NirK可将亚硝酸盐还原，这是菌株NR能将亚硝酸盐转化成气态产物的原因。通过PCR获取菌株NR的HAO的序列，结果表明菌株NR的HAO序列与传统的HAO序列存在很大的不同。传统的HAO是将羟胺转化为亚硝酸盐，而在菌株NR中，HAO除了能将羟胺转化为亚硝酸盐，还能将其转化为氧化亚氮。因此，基因序列的不同是菌株NR能将羟胺转化成气态产物的原因。有关这一新型HAO及其基因序列的研究还需要进一步深入开展。本研究对深入了解异养菌的脱氮性能、丰富和发展生物脱氮理论提供了知识积累，为构建高效生物脱氮工程菌进而开发新型生物脱氮技术提供了理论依据。