一个影响水稻叶色及株型的新型突变基因hw-1（t）的功能研究

In the preliminary studies, we identified a novel rice mutant named hfa-1, whose green-revertible albino, dwarf and high tillering were controlled by a recessive gene hw-1(t). By summarizing prior researches, it was indicated that hw-1(t), which affected the biosynthesis of carotenoid to generate an albino, dwarf and high tillering phenotype, was the first leaf-color mutant gene in monocotyledons. To verify the above assumptions, this project would from the physiological, molecular and protein levels to carry out the following researches: (1) determinate the biosynthesis intermediates of endogenous hormones (cytokinins, strigolactones) and carotenoid in hfa-1; (2) based on clear function of hw-1(t), Fluorescence Quota PCR and Gene Array will be used to detect the interaction between hw-1(t) and genes involved in carotenoid biosynthesis pathway; (3) with the yeast two-hybrid system, expressed proteins that interacted with hw-1(t) would be screened. Through above-mentioned studies, the molecular mechanism of hw-1(t) regulate carotenoid biosynthesis pathway will be clarified, and the important role of hw-1(t) in rice photosynthesis and morphosis may be investigated. The results of this project are of great significance to reveal the regulation mechanism of carotenoid biosynthesis in monocotyledonous.

在前期研究中，申请者鉴定出一个新的水稻突变体hfa-1,其叶色白化转绿、多分蘖矮杆性状受隐性核基因hw-1(t)控制。综合前人研究结果，初步推断hw-1(t)为在单子叶植物中首次发现的新型叶色突变基因，其通过影响类胡萝卜素合成产生白化和多分蘖矮杆表型。为证实上述假设，本项目从生理、分子和蛋白等方面开展下列研究：（1）hfa-1内源激素（细胞分裂素、独角金内酯）和类胡萝卜素合成中间化合物测定；（2）在明确hw-1(t)基因功能的基础上，利用荧光定量和基因芯片技术分析hw-1(t)和类胡萝卜素生物合成途径相关基因的互作关系；（3）利用酵母双杂技术，筛选与Hw-1(t)相互作用的表达蛋白。通过上述研究阐明hw-1(t)调控类胡萝卜素合成途径的分子机理，进而探讨hw-1(t)在水稻光合作用、形态构建等发育网络中的重要作用。研究结果对深入了解类胡萝卜素生物合成在单子叶植物中的调控机制具有重要意义。

一、项目背景及主要研究内容.在前期研究中，项目组通过航天搭载诱变水稻种子，从其诱变后代鉴定出一个新的水稻突变体hfa-1，其叶色白化转绿、多分蘖矮杆性状受隐性核基因hw-1(t)控制。该基因是调控类胡萝卜素及其相关激素的合成途径的新基因。本项目开展下列研究：（1）内源激素中间化合物测定；（2）突变基因hw-1(t)的图位克隆；（3）利用荧光定量和基因芯片技术分析hw-1(t)及类胡萝卜素合成途径相关基因的表达情况；（3）利用酵母双杂技术，筛选与hw-1(t)蛋白产物相互作用的表达蛋白。.二、重要结果.1、突变体hfa-1 表现出苗期白化转绿、成熟后矮秆多分蘖的独特表型。其白化表型由类胡萝卜素缺乏引起，而多分蘖矮秆表型与IAA、GA的合成途径无关。.2、通过全基因组测序与突变分析，在突变体共检测到9624个SNP和1405个INDEL，这些突变不均匀地成簇分布于全基因组。.3、结合基因组测序与连锁分析，确定hw-1(t)的候选基因为Os04g0668900。该基因是拟南芥花斑突变基因immutans在水稻上的同源基因，编码质体末端氧化酶（PTOX）。突变体hfa-1的Os04g0668900在第二外显子上出现CG>TA突变，导致转录提前终止，蛋白功能缺失。.4、PTOX的功能缺失，导致hfa-1体内缺乏类胡萝卜素，并致使叶绿素被光解而引发白化表型。然而， hfa-1白化转绿的现象，暗示hfa-1中存在对PTOX功能丧失具有补偿作用的相关途径。基因芯片结果表明，电子传递体Cytb6/f 复合蛋白合成相关基因表达明显上调，推测该复合体在电子传递和质醌库还原氧化上对hw-1(t) 起一定的补偿功能。.5、突变体成熟期仍表现矮秆多蘖，表明Cytb6/f 复合体的补偿作用并不能完全取代PTOX的功能，暗示PTOX可能具有其他未知功能。对12个与类胡萝卜素、ABA、GA和SL（独脚金内酯）代谢途径相关基因进行表达分析，发现仅SL信号传导关键基因OsD3的表达一直极显著低于野生型。通过对突变体hfa-1施加SL的类似物GR24，发现其矮秆多蘖表型得到恢复。由此推测，突变体hfa-1的矮秆多蘖是由于SL合成不足引起，暗示PTOX在SL合成中可能起到关键作用，其功能有待进一步研究。.6、利用酵母双杂交技术筛选出8个与hw-1(t)存在互作的基因，涉及多个酶类代谢途径，目前正在验证。