基于细胞弹性的微操作方法研究

As the nuclear transplantation is the crucial approach to realize somatic cell cloning, the facing challenge to the cloning experiment based on the micro manipulator robot system is how to improve the micromanipulation method in order to increase the nuclear transplantation success rate. From the view of micromanipulation, three main factors, which include the oocyte development status, the duration of nuclear transplantation operation and its corresponding wound degree, may exert impact on the nuclear transplantation success rate. These three factors have raised challenges to the micromanipulation, that is, the cell elastic modulus on-line measurement, the way of stirring the cell which would generate deterministic operation result and to seek for the optimal operation method from the feasible schemes of piercing the oocyte zona pellucida. The further study will reveal the essence of the above three challenges:the detection of cell development degree is a question of its elasticity on-line measurement; the uncertainty of stirring the cell is attributed to its elastic deformation; piercing the oocyte zona pellucida is a question of its limit elastic deformation.This project aims to study the operation method based on cell elasticity.The three research contents corresponding to the challenges of improving the nuclear transplantation success rate are as follows: 1) the study of cell elastic modulus measurement method based on the micromanipulation;2) the way of stirring the cell and its optimal stirring approach based on cell elasticity; 3)the process modeling and optimal controlling of piercing the oocyte zona pellucida; 4)the study of livestock cloning experiment oriented to the nuclear transplantation success rate.

细胞核移植是实现体细胞克隆的主要手段，如何通过微操作方法的改进，提高核移植成功率是基于微操作机器人系统的克隆实验面临的挑战。从微操作角度，影响核移植成功率主要有三个因素：卵细胞发育状况、核移植操作持续时间及创伤程度。这三个因素对微操作的挑战分别是：细胞弹性在线测量，确定性操作结果的细胞拨动方法和从可行的刺破细胞透明带方案中寻求最优的操作方法。进一步研究可以发现三个挑战的弹性本质：细胞发育程度检测，是一个弹性在线测量问题；细胞拨动结果不确定，是细胞弹性形变造成的；刺破细胞透明带是弹性形变极限问题。本项目定位在基于细胞弹性的微操作方法研究。对应提高核移植成功率的三个挑战，研究内容分别为：1）基于微操作的细胞弹性模量测量方法研究； 2）基于弹性的细胞拨动方法与最佳拨动策略研究；3）刺破细胞透明带过程建模与最优控制； 4）面向核移植成功率的家畜克隆实验研究。

本项目以基于细胞弹性的微操作方法为主线，按照项目合同书中的规定包括以下四项研究内容：.1).基于微操作的细胞弹性模量测量方法研究.2).基于弹性的细胞拨动方法与最佳拨动策略研究.3).刺破细胞透明带过程建模与最优控制.4).面向核移植成功率的家畜克隆实验研究.现已完成全部研究工作，取得主要进展如下：.1）研制了基于蓄压原理的超微量注射器,实现了优于0.1pl的高精度超微量注射。提出了基于平衡压模型的细胞弹性模量测量方法，实现了小鼠神经球细胞、家猪卵母细胞从千帕到百万帕的弹性模量测量。实现了一种基于微管吸持法的批量弹性测量方法，提高了测量弹性的速度。.2）进行了细胞拨动过程运动学分析与力学分析，提出了基于运动学的最佳拨动策略与基于最小拨动力的细胞拨动方法。实现了细胞培养液的粘性系数及细胞重量测量，最终实现了基于弹性的细胞定量拨动。.3）通过细胞实验，研究了微针刺破细胞透明带过程中细胞姿态、刺入速度，对卵母细胞后续发育的影响；通过力学仿真，进行了刺破细胞透明带过程细胞受力分析；初步探索了刺破细胞透明带过程对细胞伤害的定量评测方法。.4）实现了机器人化的卵母细胞去核操作，进行了批量去核试验，家猪卵母细胞批量去核实验达到了与手动操作一致的85%的去核率。通过抽核过程建模,探索了影响去核操作成功率的因素，进行了去核操作方法优化，将家猪克隆过程中的囊胚率从10%提高到了21%。.取得主要成果包括：.1).发表论文29篇，其中SCI收录论文11篇，包括Biomaterials，Journal of Physiology，Journal of chemical physics等顶级期刊论文。.2).申请发明专利4项。.3).培养博士研究生2名；其中1名已毕业,并获中国知网邀请基于博士论文成果撰写专著。培养硕士研究生11名，其中8人已毕业,并有1名获天津市优秀硕士学位论文。