MAD2及其选择性剪切体MAD2β在人胃癌干细胞中的表达及其对胃癌干细胞耐药调控机制的研究

细胞分裂的整个过程中,细胞内监控体系保证细胞分裂的正常进行,着丝粒相关蛋白-关卡蛋白(CP)能够准确的识别纺锤丝微管与染色体着丝粒点的连接,其中MAD2 (mitotic arrest deficient)基因编码的CP 的功能尤其引人注目，MAD2在纺锤体检测点介导的细胞死亡信号通路中具有重要作用。我们前期研究发现了一个MAD2的选择性剪切体MAD2β，其仅在胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中表达，而且MAD2蛋白表达下调和MAD2β高表达均能抑制胃癌细胞凋亡，增强细胞耐药性。但它们在肿瘤干细胞中的表达和对肿瘤干细胞耐药的调控作用和机制尚不清楚。本课拟采用实时荧光定量PCR、免疫印迹、流式细胞术等技术研究MAD2及MAD2β在人胃癌干细胞中的表达及其调控耐药机制。

胃癌是是严重威胁我国人民健康的一种恶性肿瘤。化疗是治疗胃癌的主要方法之一。多药耐药（MDR）是胃癌化疗失败的主要原因。我们前期在连续两个国科金（项目批准号：30200337，30672401）的资助下，发现着丝粒相关蛋白MAD2 (mitotic arrest deficient)及其选择性剪切体MAD2β在纺锤体检测点介导的细胞死亡信号通路中具有重要作用。其仅在胃癌耐药细胞系中表达，而且MAD2蛋白表达下调和MAD2β高表达均能抑制胃癌细胞凋亡，增强细胞耐药性。但它们在胃癌肿瘤干样细胞中的表达和对胃癌干样细胞耐药的调控作用和机制尚不清楚。本研究拟采用实时荧光定量PCR、免疫印迹、流式细胞术等技术研究MAD2及MAD2β在人胃癌干样细胞中的表达及其调控耐药机制。本研究的关键问题在于如何获得胃癌干样细胞，我们先后采取了四种方法进行实验，试图获得胃癌干样细胞。首先，我们考虑采用流式分选的方法。然而，目前仍然没有一个公认的标志物可以通过流式分选得到胃癌干样细胞，我们也无法重复出已报道标志物中的结果。其次，我们用Side population（SP）分选的方法尝试进行富集胃癌干样细胞，然而，由于该分选方法需要紫外光源和有经验的技师，我们在这两方面都有不足之处，虽经多次尝试，但没有达到良好的分选效果，没有获得胃癌干样细胞。第三，我们利用长春新碱预处理胃癌SGC7901细胞，并在无血清培养液中悬浮培养，获得一株胃癌肿瘤干样细胞，发现其耐药性比亲本细胞明显增高；且OCT4、SOX2等干性基因表达增高，体内实验也证实其克隆形成能力和裸鼠成瘤能力明显增强。第四，我们采用目前胃癌ECF化疗方案的三种化疗药物长期诱导胃癌细胞，试图富集胃癌干样细胞并阐明MAD2在其中的重要作用。我们建立了三个胃癌耐药细胞亚系，发现三个耐药细胞亚系胃癌耐药性的形成可能与MRP1相关的药物转运机制、Bcl-2/Bax和EMT介导的肿瘤抗凋亡机制增强有关。通过两次生物学重复的差异蛋白组学iTRAQ方法筛选得到了9个上调和10个下调的胃癌多药耐药相关分子，发现并验证了MAD2可能在其中发挥关键作用，但仍需进行功能和机制研究。总之，我们在胃癌干样细胞领域开展了有益的探索，这些结果将有助于加深我们对胃癌干细胞的认识，为下一步研究奠定了坚实的基础，并为从根本上控制胃癌的发生发展和多药耐药提供线索。