Furin介导急性脑缺血激活星形细胞内源性的神经保护分子机制研究

Astrocytic activation after cerebral ischemia has been well documented and was the major pathology process. Reactive astrocyte could secrete neurotrophic factors to protect neuron in cerebral ischemia，but the molecular mechanism is no clear. Furin cleavage has a critical role in themature process of neurotrophic factors. and furin expression change leaded to the neurotrophic factors secretion change. In addition,we had been found the up-regulation of BDNFmediated by furin in reactive astrocyte by oxygen-glucose deprivation. The study focus on the molecular mechanism of endogenous neuroprotection mediated by furin in reactive astrocyte induced ischemia from molecule, cell and tissue on primary culture astrocyte and trainsient middle cerebral artery occlusion model. The change of neurotrophic factors was analysised on astrocytic activation by oxygen-glucose deprivation and down-regulated furin by furin-shRNA and up-regulated furin by furin expression plasmid with immunofluorescence co-localization by confocal and Western blot analysis. The co-culture astrocyte and neuron was used to study the biological change and molecular mechanism on neuron affected by reactive astroctye in ischemia. The purpose to clarify molecular mechanism of endogenous neuroprotection on neuron and offer theory basis on clinical cerebral ischemia.

星形细胞的激活是急性脑缺血半暗带区的主要病理过程并且激活的星形细胞可分泌神经营养因子保护神经元，但其分子机制仍不清楚。而Furin在神经营养因子分泌成熟过程中起关键性作用，并且我们前期研究发现Furin介导氧糖剥离激活的星形细胞BDNF表达上调。因此本研究拟进一步从从分子水平、组织水平和动物实验三个层面探讨Furin介导的急性脑缺血时激活的星形细胞内源性神经保护分子机制研究。采用氧糖剥离诱导激活星形细胞并结合RNA干扰和Furin过表达上下调节Furin表达，并结合使用神经营养因子受体下游信号通路分子抑制剂，通过免疫荧光、共聚焦显微镜共定位以及蛋白印迹技术观察星形细胞分泌的神经营养因子变化以及对神经元功能影响。探讨Furin在缺血半暗带区激活的星形细胞神经保护功能中的重要性以及星形细胞的内源性神经保护分子机制，为临床上保护脑缺血半暗带区治疗提供理论基础。

星形细胞的激活是急性脑缺血半暗带区的主要病理过程并且激活的星形细胞可分泌神经营养因子保护神经元，但其分子机制仍不清楚。本研究采用氧糖剥离诱导激活星形细胞并结合RNA干扰和Furin过表达上下调节Furin表达，通过免疫荧光、共聚焦显微镜共定位以及蛋白印迹技术观察星形细胞分泌的神经营养因子变化以及对神经元功能影响。研究结果发现Furin通过上调星形细胞BDNF、NGF的表达介导了急性脑缺血时激活星形细胞的内源性神经保护过程； 激活的星形细胞Furin表达变化：在再灌0-12h内，与对照组相比,激活的星形细胞的Furin的表达无明显上下调。而在再灌24小时时可见Furin的表达显著升高，有统计学意义（P﹤0.01）。在再灌48小时，可见Furin的表达已转为下调，与对照组相比，有统计学意义（P﹤0.01）。激活的星形细胞的BDNF表达变化：在再灌12h开始，与对照组相比,激活的星形细胞的培养上清内的BDNF的量明显上调（P﹤0.05），随着再灌时间的延长，整体上培养上清的BDNF增加。而细胞内的BDNF在再灌24小时内表达逐步上调，0h、12h时间点可见BDNF表达轻度上调，与对照组相比，变化未达到统计学意义。而在再灌24h时可见BDNF显著升高（P﹤0.01）。在48h时，BDNF的表达已经开始下调。细胞内与培养上清的变化趋势不完全一致。 PC1/3参与了氧糖剥离诱导的海马神经元的BDNF表达下调过程海马神经元细胞经OGD诱导后：再灌12h内BDNF表达下调约30%(p＜0.01)；再灌24h时BDNF表达下调50%( p<0.01)；在再灌48h其下降约70%，72小时下调 70%。与对照组相比，有统计学意义(p<0.001)。在短暂性脑缺血再灌后缺血半暗带组织Furin、BDNF随再灌时间延长的表达变化。选取四个再灌时间点：0h, 12h, 24h, 48h。整体上缺血组皮质区的Furin、BDNF与对照组相比，表达上调。