变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸转运蛋白的功能及其调控机制

2-Keto-gluconic acid (2KGA) is the key intermediate for the manufacture of a safe food additive erythorbic acid (isoascorbic acid), and industrially produced by microbial wordwidely. Our previous study revealed that 2KGA is the target product and also the intermediate metabolite during the fermentation process. Hence how to efficiently decrease the intracellular transportation of 2KGA in the broth is the key task for improving the 2KGA fermentation yield and industrial benefits. The present proposal will focus on: 1) heterologously expressing the 2KGA transporter (KguT) of the industrail producer Pseudomonas plecoglossicida JUIM01, elucidating its structural characteristics and 2KGA-transporting models, and analyzing changes of KguT gene at transcription level; 2) elucidating the transcriptional regulation mechanism of KguT gene by investigating the intereaction of regulator PtxS, target DNA and effectors, and 3) developing and selecting the mutants with significantly lowered transportation of 2KGA by reconstruction of KguT gene or promoter regions using site-directed mutagenesis or gene knock-out methods, and comparison of the cell growth and 2KGA production/yield/producivity based on the 2KGA-transporting characteristics and regulation mechanism.

2-酮基葡萄糖酸（2KGA）是食品添加剂D-异抗坏血酸（钠）生产的关键中间体，国内外工业生产均采用发酵法。在发酵过程中，2KGA既是发酵的目的产物，也是可被生产菌株利用的中间代谢产物。因此，如何有效减少发酵液中的2KGA被转运至胞内成为进一步提升2KGA发酵水平的重要课题。本项目拟对工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01的2KGA转运蛋白KguT进行异源表达，并对其结构特征、转运特性及其编码基因在发酵过程中转录水平上的变化进行系统分析；然后，通过研究2KGA代谢的调控因子PtxS与靶DNA及效应物之间的相互作用，解析KguT的基因转录调控机制；最终，基于研究得到的KguT的转运特性及其基因转录调控机制，采用定点突变或基因敲除技术对KguT的编码基因、启动子区等进行改造，结合考察菌株生理代谢的变化，实现对菌体细胞2KGA转运过程的理性调控，得到2KGA分解代谢显著弱化的2KGA高产菌株。

2-酮基葡萄糖酸（2KGA）是食品抗氧化剂D-异抗坏血酸（钠）生产的关键中间体，在工业上通常利用假单胞菌由葡萄糖转化而来。在发酵过程中，2KGA既是发酵的目的产物，也是可被假单胞菌利用的中间代谢产物。围绕发酵过程中2KGA的分解代谢问题，本研究利用基因敲除、基因异源表达与表征以及生物信息学分析等手段，解析工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01的2-酮基葡萄糖酸转运蛋白（KguT）及相关蛋白在2KGA分解代谢中的功能；利用蛋白与效应物的相互作用、蛋白与核酸的相互作用以及转录融合等技术，阐明2KGA分解代谢相关基因的转录调控机制。研究结果表明：变形假单胞菌KguT为典型的属于MFS家族的转运蛋白，具有12次跨膜螺旋结构域，是2KGA分解代谢中必不可少的蛋白；KguT与2-酮基葡萄糖酸激酶（KguK）、2-酮基葡萄糖酸差向异构酶（KguE）和2-酮基-6-磷酸葡萄糖酸还原酶（KguD）的编码基因共处于kgu操纵子中，在培养基中的葡萄糖被消耗后发生共转录从而协同进行2KGA的分解代谢；PtxS蛋白能够与kgu操纵子的启动子区发生特异性结合，结合位点为14bp的回文序列，该位点与kgu操纵子的转录起始位点重叠；PtxS蛋白负调控kgu操纵子的转录，其效应物为2KGA。值得注意的是，KguK编码基因的敲除能够明显弱化但并不能完全阻断2KGA的分解代谢过程，KguD能够催化还原2KGA为葡萄糖酸，因而可以推测在假单胞菌中还存在着其它的2KGA代谢途径。在上述研究的基础上，利用代谢工程手段结合胞外环境优化策略，构建了2KGA分解代谢显著弱化的2KGA高产菌株变形假单胞菌JUIM01ΔkguK，其种子培养过程的生物量与亲株JUIM01相似，发酵生产中对葡萄糖的转化率可达理论产率的90%左右，能够实现对菌体细胞2KGA分解代谢过程的理性调控，有望应用于工业生产中。