铜绿假单胞菌藻酸盐（Alginate）合成相关蛋白的调控机制及功能研究

Pseudomonas aeruginosa is one of the major pathogen causing clinical acquired infection and inducing lung infection in cystic fibrosis patients. A vast range of extracellular polysaccharides are produced by P.aeruginosa in order to adapt to and thrive in diverse environmental niches. Alginate as an important exopolysaccharide that plays important roles in cystic fibrosis infection, biofilm formation and virulence phenotypes transition. Although the pathways of alginate biosynthesis have been determined and proposed in the past, the regulatory mechanisms and functions of some proteins involved in the production of bacterial alginate have yet to be fully elucidated. In this proposal, we will systematically investigate the global pathways of five proteins (Vfr, AlgP, AlgB, CysB and RpoN) using ChIP-seq and RNA-seq methods. Meanwhile, we will look for other proteins related to alginate biosynthesis from the whole Pseudomonas genome to reveal how biofilm formation, virulence gene regulation and antibiotic resistance. These results will provide us important information on how to control the pathogenecity of P. aeruginosa, which might lead to the development of new antimicrobiol compounds that specifically target these proteins in the future.

铜绿假单胞菌是引起临床获得性感染及诱发肺部纤维状病变的主要致病菌之一。它在生长过程中能分泌多种胞外多糖来适应和抵抗外界环境的变化。藻酸盐（Alginate）作为一种重要的表面多糖，在引起肺纤维囊肿病、病原菌生物膜的形成以及毒力表型的变化中起着非常重要的作用。尽管藻酸盐的合成途径在过去的研究中得以阐述，但对介导该途径中的某些重要蛋白的调控机制及其功能的认识还相当有限。本项目将运用ChIP-seq 和RNA-seq 高通量测序技术，系统地探讨参与藻酸盐合成途径中5个蛋白（Vfr, AlgP, AlgB, CysB和RpoN）的整体调控途径。同时在全基因组水平上寻找与藻酸盐合成相关的蛋白，来揭示细菌生物被膜形成、毒性基因调控、以及耐药性产生等方面的分子机制。研究结果将有助于了解铜绿假单胞菌的致病机制和抗药性形成机理，为控制铜绿假单胞菌的感染以及为开发针对以该途径中的蛋白为靶点的新型抗菌。

铜绿假单胞菌在生长过程中分泌多种胞外多糖来适应和抵抗外界环境的变化。藻酸盐（Alginate）作为一种重要的表面多糖，在引起肺纤维囊肿病、病原菌生物膜（Biofilm）的形成以及毒力表型的变化中起着非常重要的作用。尽管藻酸盐的合成途径在过去的研究中得以阐述，但对参与该途径中的某些重要蛋白的功能及调控机制的认识还相当有限。在该项目的资助下，目前取得的主要成果如下：（1）运用ChIP-seq 和RNA-seq 高通量测序技术，获得了藻酸盐合成途径中5个蛋白（Vfr, AlgP, AlgB, CysB和RpoN）的转录组数据以及这5个蛋白结合的目标基因。数据分析结果表明，除了调控藻酸盐的合成外，它们还具有许多其它重要的生物学功能。例如：Vfr能结合到合成酶siaD基因的启动子上，从而调控胞内c-di-GMP的含量及生物膜的形成；CysB调节三型分泌系统和菌体运动，并与铜绿假单胞菌的致病性密切相关。（2）我们发现铜绿假单胞菌中一个新的信号转换系统SiaA/B/C/D控制生物膜的形成及作用机制。在该信号系统中，SiaD是一个c-di-GMP合成酶，其活性依赖于SiaC，二者之间具有很强的相互作用。SiaB是一个激酶，它能磷酸化SiaC上的第68位苏氨酸，进而不能与SiaD相互作用；而SiaA是一个磷酸酶，它能使磷酸化的SiaC去磷酸化，能与SiaD相互作用，从而激活SiaD酶活，导致胞内c-di-GMP含量的增加及生物膜的形成。SiaC在该系统中起着“开关”的作用。（3）阐述了六型分泌系统（Type VI secretion system, T6SS）新的功能。在前期研究的基础上，我们找到了T6SS一个新的效应蛋白AmpDh3及它的免疫蛋白PA0808。AmpDh3通过分解细胞壁的肽聚糖抑制细菌的生长，从而使铜绿假单胞菌在细菌间竞争中取得生长优势。总之，本课题找到了多个调控致病因子表达的蛋白，为理解铜绿假单胞菌的致病机理，开发新型“抗致病力”药物提供了坚实的理论基础。