铜绿假单胞菌PQS-Fe3+内膜转运蛋白的鉴定及其功能研究

Pseudomonas quinolone signal (PQS) acts as a quorum-sensing signal molecule, controlling the expression of many virulence genes in a cell density-dependent way. In addition to its role in cell-to-cell signaling, PQS is also able to chelate ferric iron (Fe3+). Although PQS-mediated quorum sensing system has been well-characterized, the biological function of PQS in the context of iron chelating is still not clear. This proposal builds directly on our own recent study of a Pseudomonas T6SS effector recruiting PQS-containing outer membrane vesicles for iron acquisition. Our previous research and preliminary data have led to a hypothetical model in which the mechanism of PQS-Fe3+ transport across the cytoplasmic membrane in P. aeruginosa. This project aims to verify and complete this hypothetical model by using molecular biology techniques. Through the implementation of this project, we will not only identify the inner-membrane transporters for PQS-Fe3+, but also dissect the mechanism of PQS-Fe3+ transport across the cytoplasmic membrane that may lead to a major breakthrough for the research of quorum sensing and iron uptake, and provide important guidance to prevent and treat the infection caused by P. aeruginosa.

PQS作为铜绿假单胞菌群体感应信号分子，调控着许多毒力基因的表达。除了作为群体感应的信号分子，PQS还具有铁（Fe3+）螯合活性。虽然PQS在群体感应方面的研究已经取得了重大进展，但是对于PQS铁螯合活性的生物学功能仍然不清楚。本项目是在我们最近关于铜绿假单胞菌T6SS效应蛋白招募包含PQS的外膜囊泡参与PQS-Fe3+摄取的分子机制研究基础上的进一步深入。结合前期探索性研究结果我们提出了铜绿假单胞菌转运PQS-Fe3+穿过内膜的分子机制假设模型。本项目拟利用分子生物学技术对我们提出的假设模型进行验证、补充和完善。通过本项目的实施，有望鉴定铜绿假单胞菌的PQS-Fe3+内膜转运蛋白，并揭示铜绿假单胞菌转运PQS-Fe3+穿过内膜的分子机制，从而为铜绿假单胞菌群体感应系统和铁摄取系统的研究带来更深入的进展，对预防和治疗由铜绿假单胞菌引起的感染具有重要指导意义。

PQS作为铜绿假单胞菌群体感应信号分子，调控着许多毒力基因的表达。除了作为群体感应的信号分子，PQS还具有铁（Fe3+）螯合活性。虽然PQS在群体感应方面的研究已经取得了重大进展，但是对于PQS铁螯合活性的生物学功能仍然不清楚。通过本项目的实施，我们首先总结并提出了铜绿假单胞菌PQS的多功能性特征。其次，在前期关于铜绿假单胞菌T6SS效应蛋白TseF招募包含PQS的外膜囊泡参与PQS-Fe3+摄取的分子机制研究的基础上，我们进一步解析了铜绿假单胞菌转运PQS-Fe3+穿过内膜的分子机制。我们综合利用基因敲除、遗传互补、生长曲线分析、胞内金属离子含量分析、lacZ转录融、定点突变、细菌双杂交和大蜡螟感染分析鉴定了3个铜绿假单胞菌PQS-Fe3+的内膜转运蛋白或蛋白复合体（FptX、PchHI和FepBCDG）并揭示了它们的功能。然而，在研究FptX、PchHI和FepBCDG等内膜转运系统的PQS-Fe3+转运功能过程中，我们发现这些内膜转运蛋白也介导转运pyochelin-Fe3+穿过内膜，即这些内膜转运蛋白同时负责铜绿假单胞菌PQS-Fe3+和pyochelin-Fe3+向胞内的转运。通过这些研究我们最终提出了铜绿假单胞菌共转运PQS-Fe3+和pyochelin-Fe3+穿过内膜进入细胞质的分子机制模型。第三，在鉴定PQS-Fe3+内膜转运蛋白过程中，我们还发现了一个新的锌离子摄取系统，该系统由cntRLMN操纵子所编码，并提出了CntRLMN介导铜绿假单胞菌锌离子摄取的功能模型。这些研究结果为铜绿假单胞菌金属离子摄取系统的研究带来更深入的进展，对预防和治疗由铜绿假单胞菌引起的感染具有重要指导意义。