矮牵牛花色苷降解负调控转录因子PhPH4的关键靶基因筛选及鉴定

Flower pigmentation is one of the most important showy traits for ornamental plants. Thus, researches on the biosynthesis and degradation regulation of pigments in flowers are extremely important. Previous studies showed that when PhPH4 was knocked out by CRISPER/Cas9 mediated genome editing in purple flower petunia ‘M1×V30’, the purple color faded during flower blossoming, indicating anthocyanin degradation was negatively regulated by PhPH4. In this study, differentially expressed genes between PhPH4 overexpression, knockout and control plants will be analyzed by RNA-seq. ChIP-seq will be carried out to screen the DNA binding site of PhPH4. And candidate target genes will be selected and confirmed by ChIP-qPCR, yeast one hybrid and dual luciferase assays. Finally, the most important target genes will be overexpressed and mutated in petunia to evaluate their function. This project will reveal the downstream target genes of PhPH4, enrich the molecular mechanism of anthocyanin degradation, and provide theoretical and technical support for improvement of flower color of ornamental plants.

花色是观赏花卉植物的重要品质指标，因此，研究植物花色苷生物合成与降解的分子机理具有十分重要的意义。本项目前期利用基因编辑技术将紫色‘M1×V30’矮牵牛中PhPH4敲除后，发现其花瓣随着开放紫色逐渐褪去，表明该基因负调控花色苷的降解。本项目拟以PhPH4超表达和基因敲除植株为材料，利用转录组测序分析花瓣中的差异表达基因，利用ChIP-seq技术分析PhPH4蛋白的DNA结合位点，并将两者结果进行关联分析，筛选出其关键下游靶基因，然后，利用ChIP-qPCR、酵母单杂交和双荧光素酶实验进行验证，并进一步利用超表达和基因编辑技术分析关键靶基因的功能。本项目的实施对揭示PhPH4的下游调控网络，阐明PhPH4调控花色苷降解的分子机制，丰富植物花色苷降解调控理论具有重要意义，为通过基因工程手段定向改良观赏植物花色提供理论支持。

花色是观赏植物的重要品质性状之一，研究观赏植物花器官花色苷合成及其稳定性调控具有重要的意义。本研究发现PhAN4在白色花‘W115’超表达可以诱导芍药色素和锦葵色素合成而呈现紫色，而矮牵牛花色苷生物合成关键调控因子PhPH4在‘W115’中超表达花冠积累大量飞燕草素呈现红色。这两者花色有差异的原因可能是PhPH4能特异的促进PhHF2（F3’5’H）的表达从而促进花青素的B环羟基化，合成飞燕草素，而PhAN4能特异的促进PhART、PhAAT和Ph5GT的表达进一步促进花青素糖基化和酰基化，合成酰基化和糖基化的芍药色素和锦葵色素。此外，PhPH4超表达植株中编码H+-ATPase基因PhPH1和PhPH5表达显著升高，同时花冠细胞的pH值也明显降低，说明PhPH4也可能通过调控PhPH1和PhPH5的表达使PhPH4超表达植株花冠细胞酸度降低，这也可能是PhPH4负调控矮牵牛花色苷降解的重要原因之一。在PhPH4敲除和超表达的‘M1×V30’植物中也进一步证明了PhPH4具有抑制花色苷降解和促进花色苷的生物合成的功能，花色苷降解可能与花色苷组分和细胞的酸度相关。此外，通过ChIP-seq技术鉴定了包括花色苷生物合成相关基因、细胞膜相关基因、信号转导相关基因和部分转录因子等靶基因，我们重点分析了其中一个靶基因PhMYBX1，该基因在花冠和子房中高表达，亚细胞定位分析其主要定位于细胞核，受PhPH4的直接调控，抑制花色苷的合成。本研究为深入研究花色苷的生物合成和稳定性奠定了基础，也为利用基因工程手段创制新花色矮牵牛品种提供了思路。