细胞蛋白14-3-3ε调控非结构蛋白NSP2介导的aggresome-自噬通路的机制研究

Aggresome-autophagy pathway is essential for removal of protein aggregates to prevent their cytotoxicity. Viruses can activate aggresome-autophagy pathway to facilitate their replication. 14-3-3 is a multifuction cellular protein that is involved in regulation of aggresomes formation and autophagy. Here we found that PRRSV nonstructural protein 2 (NSP2) promoted aggresomes formation and aggresome-mediated autophagy in 293T cells. Interestingly, NSP2 can directly interacts with 14-3-3ε. However, the role of 14-3-3ε in NSP2-mediated aggresome-autophagy is unknown. Based on our preliminary data, we hypothesize that NSP2 activates aggresome-autophagy pathway under the regulation of 14-3-3ε. This proposal will determine the role of 14-3-3ε in NSP2-induced autophagy, the protein ligands of 14-3-3ε in aggresome-autophagy pathway, and the interaction domain of NSP2 and 14-3-3ε protein. We will further examine the effected of NSP2-mediated autophagy on PRRSV replication. The project will provide key findings that explain the role of NSP2 in PRRSV pathogenesis and can be exploited therapeutically.

Aggresome-自噬是细胞清除垃圾蛋白聚集体进行自我修复的关键途径。多功能细胞蛋白14-3-3在aggreomses形成和调控自噬过程中发挥重要作用。我们前期发现PRRSV的NSP2能够通过14-3-3ε诱导aggresomes形成和激活自噬并对PRRSV感染产生影响，但具体机制尚不清楚。本项目将进一步研究14-3-3ε在NSP2诱导的自噬中的作用及自噬对PRRSV感染的影响；鉴定aggresome-自噬通路中与14-3-3ε相互作用的关键宿主蛋白并分析这些蛋白对PRRSV感染的影响，探索14-3-3ε在aggresomes招募、运输、自噬起始、自噬体形成等作用节点中功能；鉴定14-3-3ε与NSP2结合的关键区域。阐明14-3-3ε对NSP2介导的aggresome-自噬通路的调控机制。本研究为深入了解NSP2在PRRSV感染过程中作用机制和挖掘治疗PRRS新药物靶分子奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是危害养猪业首要病原之一。PRRSV的基因组具有高变异性，现有疫苗的保护力不理想，加上缺乏有效药物，致病机制尚不完全清楚，使得该病更加难以防控。在该项目的支持下，发现细胞蛋白14-3-3ε参与PRRSV的非结构蛋白2（NSP2）诱导的aggresomes的形成，NSP2也可激活细胞自噬并且该自噬的激活依赖于aggresomes的形成，证明NSP2可激活aggresomes-自噬途径，14-3-3ε在自噬起始过程中起作用。进一步的研究发现14-3-3ε通过与NSP2的tail区域的“RTAP”基序诱导aggresomes-自噬形成。NSP2的表达定位于线粒体膜，与MAVS具有相互作用，14-3-3ε在PRRSV感染下可抑制IFN-α和IFN-γ的表达，同时降低其下游抗病毒基因OAS1、GBP1等的表达，揭示了NSP2拮抗先天性免疫反应的新机制。在此基础上发现了14-3-3ε蛋白的抑制剂Difopein及其特异性的siRNA能显著性的降低PRRSV感染，可作为抗PRRSV感染的药物。研究还发现紧密链接蛋白CLDN4在PRRSV感染早期的机制进行了研究，研究发现CLDN4的ECL2区域多肽可有效的阻断PRRSV感染，并能中和病毒，从新的角度揭示了PRRSV的致病机制，并为新的治疗性抗病毒药物提供思路。同时建立了NSP4蛋白的ELISA方法，该方法能弥补商品化试剂盒检测不到阳性样品。以上的研究结果为PRRS的防控提供了坚实的理论基础和物质平台。