多细胞生物特异性自噬蛋白EI24调控自噬的机制研究

Autophagy is a lysosome-dependent degradation pathway, which is evolutionary conserved among eukaryotes. The hallmark of autophagy is the formation of autophagosomes, which fuse with lysosomes after maturation and the contents are hydrolyzed by enzymes in lysosomes. Genetic screens in yeast identified a series of proteins regulating the formation of autophagosome, which are divided into different complexes and regulate different steps in autophagy. Our lab, using Caenorhabditis elegans as a model organism, performed a genetic screen for genes involved in autophagy in multi-cellular organisms and identified many multicellular organisms -specific autophagy genes, including EPG-4/EI24. In C. elegans, epg-4 mutant shows severe accumulation of autophagy substrates. Ei24 conditional knockout mice also show strong autophagy defects. But until now, it is totally unknown for how EPG-4/EI24 regulates autophagy. In this proposal, we are going to construct EI24 knockout in different cell lines and by using cell biology and biochemistry and other technologies, we will investigate the molecular mechanism by which EI24 regulates autophagy. These studies will give us a clearer understanding of the autophagy process of multicellular organisms and also provides potential drug targets for the treatment of autophagy-related diseases

自噬是真核细胞中的一种在进化上保守的降解途径。自噬过程的一个显著标志是自噬体的形成，自噬体成熟后与溶酶体融合，其内容物被溶酶体中的酶降解。基于酵母遗传筛选鉴定了一系列调控自噬体形成的蛋白，这些蛋白被分为不同的蛋白复合体，分别调控了自噬体形成的不同阶段。本实验室以秀丽隐杆线虫为模式生物，筛选鉴定了包括EPG-4/EI24在内的多个多细胞生物特有的自噬基因。在线虫中，epg-4突变体表现出严重的自噬底物累积。小鼠中的研究也发现，Ei24条件性敲除的小鼠也表现出很强的自噬缺陷表型。但目前，EPG-4/EI24调控自噬的机制完全不清楚。本项目中，我们将在不同细胞系构建EI24敲除细胞，利用细胞生物学、生物化学等手段，研究EI24调控自噬的分子机制。这些研究将使我们对多细胞生物的自噬过程有更清楚的了解，也为自噬相关疾病的治疗提供可能的药物靶点

自噬是真核生物细胞中的一种在进化上保守的降解途径，包括起始、前体膜的延伸、自噬体的闭合、自噬体与溶酶体融合和降解等一系列步骤。多细胞生物特有自噬蛋白EPG-4/EI24的缺失在线虫和小鼠中都表现出很强的自噬缺陷表型。但目前，EPG-4/EI24调控自噬的机制完全不清楚。本项目中，我们在不同的细胞系中构建EI24敲除细胞，利用细胞生物学、生物化学等手段，研究EI24调控自噬的机制。研究结果显示，自噬的激活刺激内质网钙离子的持续释放，使内质网外膜表面形成局部高浓度钙离子。这一局部区域的高浓度钙离子促使自噬起始复合体ULK1复合体通过液-液相分离的方式形成蛋白聚集体，进而招募其他相关蛋白逐步形成自噬体。ULK1复合体蛋白聚集体的形成与稳定需要关键蛋白亚基FIP200和ATG13，同时也需要另一个关键自噬蛋白ATG9以及内质网上的跨膜蛋白VAPs和ATL。在EI24缺失的细胞中，内质网钙离子持续释放，激活的自噬也不能顺利进行下去，表现为早期自噬蛋白的大量累积和自噬体早期结构的大量累积。这一结果表明，内质网钙的释放是自噬起始所必需的，但并不需要一直持续的。这一过程需要EI24的参与从而实现精确调控。EI24通过与内质网上的钙泵SERCA和钙通道蛋白IP3Rs，SEC61A等的相互作用实现对自噬体形成过程中钙释放的调控。我们的发现解决了自噬在哪里起始的关键问题，也揭示液-液相分离现象在自噬多个阶段都存在，而不仅仅是之前报道的自噬底物的降解依赖于液-液相分离。