瘦素受体胞外区脱落的分子机制研究

瘦素由肥胖基因编码，具有抑制食欲、调节能量代谢、神经内分泌、生长、生殖和免疫反应等多种功能。近年发现，跨膜瘦素受体的脱落在调节瘦素信号功能中具有至关重要的作用，但其机制尚不清楚。本研究拟开展如下工作：（1）结合瘦素受体脱落产物的分子大小，构建胞外域相关位点的缺失突变体，从而鉴定瘦素受体进行蛋白裂解的位点；（2）采用金属蛋白酶抑制剂，初步鉴定参与瘦素受体脱落的金属蛋白酶类别，进一步采用siRNA基因干扰，鉴定出相关的酶；（3）构建瘦素受体-绿色荧光蛋白（OB-Rb-GFP）基因融合表达质粒，观察OB-Rb-GFP在细胞内的分布及受TNF-a刺激后在细胞内的分布变化；（5）采用Western Blotting观察TNF-a刺激瘦素受体脱落后，细胞内瘦素信号转导功能的变化，及其对细胞增殖、凋亡等功能的影响。本研究对阐明瘦素生物学活性的调控、防治与瘦素功能异常相关的疾病有重要的理论及临床意义。

瘦素由肥胖基因编码，具有抑制食欲、调节能量代谢、神经内分泌、生长、生殖和免疫反应等多种功能。近年发现，跨膜瘦素受体的脱落在调节瘦素信号功能中具有至关重要的作用，但其机制尚不清楚。为此，我们在培养的细胞中主要开展了如下三个方面的工作：1）通过腺病毒介导全长OB-Rb转染293细胞过表达瘦素受体，采用ELISA法测定脱落在细胞培养上清中的可溶性瘦素受体（sOB-R）含量，结合应用基质金属蛋白酶抑制剂、siRNA基因干扰技术，鉴定特定基质金属蛋白酶对瘦素受体胞外区切割的影响；2）通过构建瘦素受体-绿色荧光蛋白（OB-Rb-GFP）基因融合表达质粒，观察了转染的细胞内OB-Rb-GFP的分布及TNF-α刺激后在细胞内分布的变化；采用信号通路及蛋白质胞内转运的阻断剂，对TNF-α刺激瘦素受体向细胞膜转运的分子机制进行深入的观察；3）为了直接观察TNF-α对瘦素效应细胞功能的影响，我们在培养的大鼠胰腺癌细胞系（INS-1E）和大鼠原代胰岛中，观察了TNF-α和瘦素单独或联合作用对胰岛素合成、分泌、β细胞的增殖与凋亡等功能的影响。研究结果证实：1）Adam10、Adam17及MMP14参与了瘦素受体的胞外脱落；2）在培养的多种细胞（包括外周组织细胞HepG2、293及中枢神经细胞N2A、GT1-7）中，TNF-α都能显著刺激瘦素受体向细胞膜的快速转运及随后的胞外区裂解脱落，从而增强细胞上清中sOB-R的水平，增强瘦素刺激的细胞内JAK/STAT3信号途径；3）在胰岛β细胞中，TNF-α可以干扰瘦素对β细胞胰岛素合成和分泌的抑制作用，抑制长型瘦素受体(OB-Rb)在β细胞上的表达，抑制瘦素刺激的JAK/STAT3的信号途径；同时，TNF-α还能拮抗瘦素诱导β细胞凋亡的作用。.本研究拓展了对瘦素功能调控机制的认识。首先：1）在细胞水平，为炎症因子（如TNF-α）调节瘦素的信号功能提供了直接证据；2）鉴定出参与瘦素受体胞外区脱落的酶（MMP-14、ADAM-10及ADAM-17），这为干预瘦素功能异常相关疾病提供了潜在的新靶点；3）TNF-α干扰瘦素对β细胞胰岛素合成和分泌的抑制作用，这可能是慢性炎症导致β细胞瘦素抵抗的新机制，提示肥胖者体内升高的TNF-α可能通过拮抗瘦素的功能在肥胖伴随的高胰岛素血症的发生及葡萄糖代谢紊乱中具有重要意义。