M2巨噬细胞影响肾脏系膜细胞的作用及其机制的实验研究

巨噬细胞对肾脏炎症反应和免疫应答等过程和结局具有重要影响。系膜细胞为肾小球肾炎和肾脏纤维化过程中的重要效应细胞之一。根据已有文献报导和课题组前期研究发现，我们推测在肾炎病理过程中 M2巨噬细胞可能具有促进MsC的增生、影响MCP-1/CCL2及细胞外基质等表达的作用，并且可能在肾炎病变中具有一定的肾脏保护作用。本课题拟采用IL-4刺激大鼠BMDM获得外源性M2表型巨噬细胞，并建立M2与大鼠MsC体外共培养体系和大鼠抗Thy-1系膜增生性肾炎模型，并以此观察M2对MsC及其表达ECM/CCL2的影响，以及M2巨噬细胞在体外肾炎模型中是否具有潜在的治疗作用。本课题预期研究结果将明确M2对MsC生长及细胞外基质作用的影响及其相关机制， 有利于进一步了解和认识巨噬细胞与系膜细胞的相互作用。该研究对于进一步开展肾炎病变治疗的实验研究也将具有重要的理论意义和应用价值。

本课题采用体外共培养方式研究M2巨噬细胞与MsC相互作用，及其可能机制；在大鼠抗Thy-1肾小球肾炎模型中回输M0、M2两型巨噬细胞，观察上述干预对肾小球肾炎相关指标的影响，以及对MsC的增生及细胞外基质沉积的作用与相关机制。1、探讨替代激活的M2巨噬细胞对大鼠系膜细胞的促凋亡作用及相关机制。采用大鼠骨髓源性巨噬细胞与大鼠系膜细胞共培养的模型(直接接触共培养，M2巨噬细胞条件培养上清转移两种方式)，以Hoechst33258染色观察细胞凋亡，流式细胞术检测凋亡细胞比例；Western Blot检测caspase3、Bcl-2、Fas、PI3K/Akt等表达；分析精氨酸酶-1的活性变化。研究结果提示M2巨噬细胞培养液上清所诱导的系膜细胞凋亡可能是由Fas介导的，由此可以认为M2细胞在肾脏炎症状态下起到调控系膜细胞凋亡与增生平衡的作用。2、探讨替代激活的M2巨噬细胞条件培养上清对大鼠系膜细胞FN分泌的调节作用及相关机制。采用大鼠骨髓源性巨噬细胞与大鼠系膜细胞共培养模型，(直接接触共培养,M2巨噬细胞条件培养上清转移两种方式)，使用Western blot和/或PCR检测med、50%M1-MPCM、50%M2-MPCM作用48小时后大鼠MsC中FN、p-ERK、p-JNK、p-p38、MCP-1、MMP3、TGF-β1与 TIMP-1的表达。研究结果提示M2巨噬细胞的条件培养上清可调节系膜细胞FN的分泌，TIMP-1、p-Erk、 p-p38可能参与上述效应。3、研究体外输入骨髓来源的M2巨噬细胞对大鼠抗Thy-1肾炎模型的作用。通过荧光标记不同体外激活状态的巨噬细胞，经肾动脉回输至抗Thy-1肾炎大鼠体内，记录大鼠肾功能相关指标(尿蛋白与尿肌酐水平)，Realtime-PCR方法观察体外输入骨髓来源M2巨噬细胞对抗Thy-1肾炎大鼠肾功能作用机制。在体外回输M0与M2巨噬细胞的抗Thy-1肾炎大鼠肾组织中可发现荧光标记的巨噬细胞存在于肾小球内。与对照组相比抗Thy-1肾炎对照组大鼠尿液中尿肌酐与尿蛋白水平明显升高。体外回输M2巨噬细胞+抗Thy-1肾炎组中尿肌酐与尿蛋白水平显著低于体外回输M0巨噬细胞+抗Thy-1肾炎组。研究结果证实M2巨噬细胞的回输不会使抗Thy-1肾炎大鼠的肾功能进一步恶化，MR的mRNA水平升高可能与M2的上述效应有关.