基于非血红素型双铁离子氨基氧化酶定向进化构建合成广谱亚硝基中间体的合成生物学元件

Nonheme diiron N-oxygenases catalyze various amine oxidization, and are key metalloenzymes in both primary and secondary metabolism. Up to now, there is only few nonheme diiron N-oxygenases reported, most of which oxidize amine substrates to nitro products. Amine oxidization produces nitroso group and hydroxylamine as well, both of which are powerful synthons in the synthesis of various nitrogen containing bonds and heterocycles. However, there is no broad-substrates-range nitroso producing enzyme reported yet. In previous study, we have discovered a new nonheme diiron N-oxygenase AzoC, which can oxidize amine to nitroso products. Unfortunately, AzoC has a sharp substrates specificity, and it is unsuitable for the direct use in synthetic biology as biological part. Meanwhile, the canonical nonheme diiron N-oxygenase AurF can catalyze the oxidization of amine to nitro with a broad substrates range. Hence, AurF and AzoC are complimentary in catalytic activity and substrates specificity. Therefore, this project is designed for the directed evolution of AzoC and AurF with DNA-Shuffling method, and aims at constructing a new biological part for the oxidization of broad range amine substrates to nitroso intermediates. This study will provide a model for the directed evolution of nonheme diiron N-oxygenase, and will expand their use in synthetic biology.

非血红素型双铁离子氨基氧化酶催化与氨基相关的一系列氧化反应，是初级代谢以及次级代谢中重要的金属酶。目前已报道的该类酶大多氧化氨基为硝基。除了硝基之外，氨基氧化还可以产生亚硝基、羟胺等中间体。这些中间体是合成多种含氮基团和含氮杂环的重要合成子。迄今为止，尚无氧化广谱氨基底物为亚硝基的氨基氧化酶报道。前期研究中，我们发现了一个新的非血红素型双铁离子氨基氧化酶AzoC，其可氧化原生底物为亚硝基。但是，AzoC的底物谱窄，不适合直接开发为合成生物学元件。此类酶中的经典酶AurF虽然氧化氨基为硝基，但底物谱宽，与AzoC具有功能和底物谱上的互补性。因此，本项目拟以AzoC及AurF为亲本，利用DNA-Shuffling定向进化技术对二者底物谱和活性进行扩展，构建可氧化广谱氨基底物为亚硝基的新功能合成生物学元件，为非血红素型双铁离子氨基氧化酶的定向进化提供方法基础，并扩展此类酶的合成生物学应用空间。

本项目利用定点突变技术结合酶的理性设计理念，构建了两代可氧化广谱苯胺类底物为亚硝基中间体的生物合成元件（AzoC-II及AzoC-III），证明了理性设计策略可用于非血红素型双铁离子氨基氧化酶的底物谱改造，为此类酶的定向进化提供了科学基础。.此外，本项目还利用构建的合成生物学元件，结合组合生物合成理念，设计了两条新的生物合成通路。构建的新生物合成通路1，利用AzoC-II为生物催化剂，以对位及间位取代的苯胺类化合物为底物合成亚硝基中间体，以不同骨架的酚类为亚硝基受体，构建了酚类化合物的芳环C-H键活化新方法，并生物合成了一系列具有抗HIV及抗阿兹海默症活性的联二芳胺类活性分子。构建的新生物合成通路2，利用AzoC-III为催化剂，以邻位、间位及对位取代的苯胺类化合物为底物合成亚硝基中间体，以间苯三酚为亚硝基受体，利用底物设计、反应条件优化等方式构建了生物催化的苯环缩环反应新方法，生物合成了一系列具有抗癌活性的二氨基取代环戊二酮烯活性分子。.项目执行期间，发表论文5篇，含2篇Nature Communications（Nature子刊，中科院一区TOP，IF：17.694），1篇ACS Catalysis（中科院一区TOP，IF：13.7）2篇Chemical Communications（中科院二区TOP，IF：6.065）；，受理发明专利1项。此外，还有2篇文章正在投寄以及准备投寄。.综上所述，本项目圆满完成了计划规定的任务，达到了预期目标。