果蝇一个新F-box蛋白功能的研究

We uncovered a novel F-box protein-encoding gene, Fbxlp (F-box leucine-rich protein) during a genetic screen. Ubiquitous overexpression of Fbxlp results in small-size flies. The area of the posterior compartment of the wing is significantly reduced when Fbxlp is ectopically expressed in this area. These preliminary ovservations indicate that Fbxlp may play a role in the regulation of cell number and/or cell size during Drosophila development. Yeast two-hybrid data indicates that Fbxlp interacts with Skp1,a component of the ubiquitination E3 liage SCF complex, and an un-characterized Cdk like protein. We cloned the Cdk like gene,Caklp,which encodes a protein similar to Cdk activiting kinase（CAK）. HA-Fbxlp interacts with Flag-Caklp physically in S2 cells. The protein level of Flag-Caklp is reduced when HA-Fbxlp is co-expressed. We hypothesize that as a component of the SCF complex, Fbxlp mediates the ubiquitination of one of its substrates,Caklp. In this application we aim to identify substrate(s) of Fbxlp and reveal the molecular mechanism of its function using genetic,cell biological and biochemical methods.

通过遗传筛选我们发现一个编码F-box蛋白的果蝇新基因Fbxlp（F-box leucine-rich protein）。全身表达该基因产生小体型果蝇；在翅膀后部过量表达导致该区域面积缩小，提示该基因可能参与发育过程中细胞数目或大小的调控。酵母双杂交显示Fbxlp与泛素连接酶SCF复合物的亚基Skp1、Cdk类似蛋白等有相互作用。Cdk类似蛋白与CAK（Cdk activiting kinase）有较高同源性，命名为Caklp（CAK like protein）。免疫共沉淀（Co-IP）显示果蝇S2细胞中表达的HA-Fbxlp与Flag-Caklp相互结合，并引起 Flag-Caklp蛋白水平下降。我们推测Fbxlp是SCF复合物的亚基，Caklp是其介导的泛素化底物之一。我们将利用遗传学、细胞生物学和生物化学等方法鉴定Fbxlp的底物，并进一步揭示Fbxlp生物学功能的分子作用机理。

通过遗传筛选我们发现一个编码F-box 蛋白的果蝇新基因Fbxlp（F-box leucine-rich protein）。我们利用最新开发的CRISPR/Cas9技术通过NHEJ（Non-homologous end joining）和同源重组两种形式获得了Fbxlp突变体。另外还用这一技术在Fbxlp碳端敲入了Myc标签。在应用中针对重组时可能产生 “ends-in”造成有干扰的重复序列问题，我们还提出了一个通过在供体中引入loxP序列解决的方案。Fbxlp突变体纯和不致死，但发育迟缓，果蝇成体较明显的表型是翅略大。有超过四分之一的突变体小盾板有多余的刚毛。敲低Fbxlp也有翅略大等表型。我们获得了UAS-HA-Fbxlp转基因果蝇，与突变体相反全身过表达该基因产生小体型果蝇；在翅膀后部过量表达导致该区域面积缩小。进一步分析显示Fbxlp对于翅发育的作用是调控细胞数目而非细胞大小。酵母双杂交显示Fbxlp与泛素连接酶SCF复合物的亚基SkpA以及Cdk 类似蛋白(Caklp)等有相互作用。与SkpA的遗传相互作用和生化实验提示Fbxlp为泛素连接酶SCF复合物的亚基。我们也获得了UAS-Flag-Caklp转基因果蝇，但过表达Caklp不能挽回过表达Fbxlp的表型，在成虫盘中免疫荧光染色未见过表达Fbxlp引起Caklp蛋白水平下降，因此不能确定Caklp为Fbxlp的主要底物。我们现有的研究发现Fbxlp在翅的发育过程中起作用。已知翅的发育受Hedgehog、Notch、Dpp、Wingless 等信号通路调控，目前正通过遗传筛选将Fbxlp锁定在1-2个通路上，从而进一步发现它的底物，揭示其功能的分子机制。另外，也可以利用质谱分析潜在的底物。