长链非编码RNA UCA1在肺腺癌顺铂耐药中的生物学功能及其分子机制研究

Long chain of non-coding RNA (lncRNAs) involved in the cisplatin resistance mechanisms in lung adenocarcinoma (LAD), while that in LAD are still unclear. Our previous work demonstrated that lncRNA UCA1 was significantly increased in A549/DDP and cisplatin resistance significantly reversed after siRNA, suggesting that it may be a new lncRNA molecule related to cisplatin resistance in LAD. While it’s biological function and molecular mechanism is unknown. The project intend to detect the RNA level of UCA1 and relationships with chemotherapy, nude mice confirmed UCA1 role. In vitro experiments, cell lines is made for over-expression and siRNA, observed the changes of biological behavior of tumor cell. Dual luciferase experiments confirmed UCA1 regulation of miRNAs. We establish CRISPR/Cas9 UCA1 knockout cell lines and obtain downstream signaling pathways or molecules. RNA-pulldown technology get UCA1 binding proteins and interaction mechanisms. The work will systematically study and clarify biological function and molecular biological mechanisms of UCA1 and may provide new markers for the LAD cisplatin resistance.

长链非编码RNA（lncRNAs）参与了肺腺癌（LAD）顺铂耐药发生机制，但目前国内外对lncRNA 在LAD顺铂耐药中相关研究尚处于起步阶段。我们前期工作证实LAD顺铂耐药株A549/DDP的lncRNA UCA1表达水平明显升高，UCA1 siRNA后顺铂耐药发生明显逆转，故推测UCA1可能与LAD顺铂耐药密切关联新lncRNA分子，但其生物学功能及分子机制未明。本项目拟检测LAD血清UCA1水平及与化疗疗效关系，裸鼠成瘤证实UCA1作用。UCA1过表达及siRNA前后观察顺铂敏感及耐药细胞株的肿瘤学行为变化；双荧光素酶实验证实UCA1调控miRNA分子；CRISPR/Cas9建立UCA1敲除细胞株，获得UCA1调控下游信号通路或分子；RNA-pulldown等技术获得UCA1结合蛋白和互作机制；来系统性研究及阐明UCA1生物学功能和分子机制，该研究可能为LAD顺铂耐药提供新标志物。

我们前期实验进一步显示了对UCA1 RNA干扰（siRNA）后，A549/DDP细胞的迁移、侵袭能力明显下降，顺铂耐药得到明显逆转；故我们推测UCA1可能在肺腺癌对顺铂耐药中的一个起重要作用的新lncRNA分子，但机制未明。主要研究内容：1.检测肺腺癌患者外周血清UCA1水平，并分析其与化疗疗效的关系。2.裸鼠成瘤实验及对顺铂治疗的影响。3.对UCA1进行过表达及RNA干扰前后，观察A549、SPCA-1细胞及A549/DDP、SPCA-1/DDP细胞的肿瘤学行为及顺铂IC50浓度变化；实时荧光定量PCR及western blot法检测顺铂耐药相关基因。4.UCA1调控相关miRNA的研究。5.获得UCA1调控的下游信号通路或分子。6.UCA1特异性结合蛋白质获得、验证及调控机制研究。重要结果及关键数据：1.证实了UCA1 分子在LAD 组织中表达明显增高，与转移、临床分期密切关联，UCA1可作为肺腺癌患者预后生物标志物。肺腺癌顺铂治疗后出现完全缓解、部分缓解、无变化，进展的肺腺癌外周血清UCA1表达水平分别出现逐步升高；提示了UCA1是反映LAD 顺铂治疗效果及预测顺铂耐药的一个重要的lncRNA分子。2.细胞核浆分离结果显示了，UCA1定位于细胞浆。细胞学实验提示了UCA1 具有使LAD 细胞迁移，侵袭，增殖、克隆、顺铂IC50水平明显增强，并且在顺铂药物作用下，UCA1仍能够增强LAD 细胞迁移，侵袭，增殖、克隆形成能力，UCA1能降低肺腺癌对顺铂药物敏感性。进一步获得miR-122-5p、miR-203a、miR-143、miR-135a、miR-135b作为UCA1的互作miRNA分子参与肺腺癌的顺铂耐药发生。3.裸鼠成瘤实验证实敲低UCA1 表达明显降低裸鼠成瘤能力；成功构建了UCA1 cas9敲除A549/DDP细胞株；进一步通过RNA pulldown和RIP技术获得UCA1结合蛋白ENO1 蛋白，显示了UCA1可能通过结合蛋白ENO1共同在肺腺癌中起作用；进一步通过测序及qPCR验证并获得一些UCA1参与肺腺癌顺铂耐药的下游关键分子纤维蛋白原, MYC, 铜蓝蛋白等。通过本项目研究，提示UCA1有望成为肺腺癌顺铂耐药预测的生物标志物及干预靶点。