P16基因甲基化DNA氧化位点的功能及其临床应用潜能

5-Methylcytosine (5mC) in genomic DNA can be oxidized by TETs to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC). As intermediate products in active DNA demethylation, 5fC and 5caC residues can be excised from genomic DNA by TDG. Instead of excision, a certain proportion of 5hmC and 5caC may persistently exist in genomic DNA. Functions of these oxidized forms of 5mC in genomic DNA remain elusive. In some cancers, the global level of 5hmC is decreased while that of 5caC is increased. The mechanism of regulation of further oxidation of 5hmC in cells is unknown either. In our recent studies, we found for the first time hydroxymethylation in P16 CpG islands and observed a close relationship between P16 hydroxymethylation and development and metastasis of gastric carcinoma. Moreover, we constructed an artificial P16-specific TET1 enzyme and used it to successfully establish a cell model of P16 hydroxymethylation and transcriptional re-activation. In the present project, we are going to use the model to explore critical regulation factors for 5hmC to 5acC conversion and subsequent excision. We will also study the transcription capability of these oxidized forms of methylated P16 alleles, characterize transcription factors and modification patterns at histone H3 lysine 4/9/27 and DNA accessibility. The relationship between P16 hydroxymethylation and development and progression of gastric cancers will be further validated in case-control and prospective cancer patient cohorts.

DNA 5-甲基胞嘧啶可经TETs催化形成5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基/羧基胞嘧啶。后者既可作为中间产物，被TDG切除修复参与DNA主动去甲基化，也可同前者一样长期存在于基因组中，其功能和控制这些氧化产物氧化程度的因素不明。在部分肿瘤发生过程中，全基因组DNA总羟甲基化水平降低和羧基化水平升高，主要见于基因区及远程调控元件。我们首先发现P16基因CpG岛也存在羟甲基化现象，并且与人胃癌的发生和转移关系密切，进一步还构建了P16启动子特异性的羟甲基化酶，能够诱发P16基因羟甲基化和转录激活。在本项目中，我们拟在该细胞模型上研究控制甲基化P16 DNA氧化和切除修复过程的关键因素，确定不同氧化状态P16的转录活性，鉴定其与转录因子WT1的结合和组蛋白修饰特征及染色质的可接近性；同时确定P16羟甲基化与胃癌发生发展的关系，为明确肿瘤抑制基因羟甲基化及其氧化产物的功能和用途奠定基础。

羟甲基化胞嘧啶（5hmC）是甲基化胞嘧啶的氧化产物，由TET1-3催化，可存在于基因组DNA中，功能不明。我们前期研究发现，p16基因DNA甲基化能够直接抑制基因转录，在肿瘤发生的癌前病变阶段开始出现，与癌前病变癌变密切相关，可用于预测口腔黏膜上皮异型增生恶性转化。进一步又观察到p16基因转录起始点附近的CpG岛还存在DNA羟甲基化现象(p16-hmC)。据此，对p16-hmC与基因转录的关系及其在肿瘤发生发展中的作用开展深入系统的研究。我们首先对HCT116肿瘤细胞中p16 CpG岛中5hmC位点分布规律进行了分析，发现这些5hmC位点主要分布于该基因5'UTR区直接用于指导hnRNA合成的模板链（反义链）上；通过将已有的p16启动子DNA特异性人工七锌指结合蛋白与TET1的氧化酶催化域融合，进一步构建了p16氧化酶（p16-TET），可诱导H299和AGS细胞中甲基化沉默的p16基因氧化和去甲基化以及转录激活；深入分析见，p16-hmC仅存在于没有P16蛋白表达的细胞亚群中，说明存在羟甲基化的p16基因与单纯甲基化的p16基因一样，没有转录活性；用siRNA特异性敲降TET1-3表达后，HCT116细胞中的p16-hmC形成大幅度减少，对DNA甲基化阻断剂（DAC）等转录激活p16基因表达的敏感性大幅度下降，提示高密度5hmC的存在能够增加细胞对甲基化失活基因转录激活的敏感性。通过在口腔黏膜上皮异型增生患者中开展前瞻队列研究，我们首次发现p16-hmC与p16单纯甲基化一样，都能增加上皮异型增生病灶的癌变风险，不需要进行细分。本研究结果首次证明：（1）p16羟甲基化能够增加基因转录激活的敏感性，但是仍然保持转录沉默状态；（2）在利用p16甲基化为癌变预测分子时，不需要单独测定p16-hmC。这些发现不仅有理论意义，而且有直接的临床应用价值。