三阳血傣的温阳作用对白血病细胞生物学特性的影响

肿瘤干细胞以其独特的对外界药物无所反应的封闭特性而使清除性治疗一筹莫展。古老的《黄帝内经》阐述"阴阳者…生杀之本始"，"万物之能始也"，阴阳为生长死亡的起始原点，为肿瘤干细胞特性的改变提供了崭新的研究思路。肿瘤是阴寒离阳之物，阴阳调节以温阳为主，阴阳调节药不在激烈杀灭细胞，而在缓和诱变细胞。为此，采用Caco-2单层细胞培养法模拟中药血清药理学方法给药，观察云南特色有效的三阳血傣中温阳药物对白血病细胞及其干细胞的诱导驯化作用，以此改变恶性细胞的阴阳状态，将其从静止封闭的阴态提升至激活开放的阳态。通过流式细胞仪和细胞集落培养法测定温阳药激发后的K562细胞株细胞周期、细胞凋亡、CD34+38_细胞亚群变化、细胞克隆增殖以及对化疗的敏感性改变，明确温阳中药有效成分对白血病及其干细胞生物特性的影响程度，为白血病尤其是白血病干细胞治疗久攻不下寻求突破的新途径。

对三阳血傣中的肉桂所含桂皮醛和大回阳饮所含附子里的新乌头碱有效成分提取并纯化。体外吸收模型的已成功建立：Caco-2细胞单层细胞培养21天，细胞达到汇合分化，用上皮电阻仪测量细胞单层的跨膜电阻TEER。测试细胞的完整性。进行电子显微镜拍照。桂皮醛对K562细胞的无细胞毒的浓度范围为50μg/ml-75μg/ml，新乌头碱对K562细胞的无细胞毒的浓度范围为25μg/ml-50μg/ml。与对照组（只加入DMSO组）相比，能抑制K562细胞生长，且呈浓度、时间依赖性（P<0.05），作用时间为72小时，抑制效果明显。流式细胞仪检测白血病细胞的细胞周期状态，测定G1/S期细胞所占比例。实验结果显示，50μg/ml桂皮醛作用K562细胞，S期比例上升了4.32%；75μg/ml桂皮醛作用K562细胞，S期比例上升了11.73%。25μg/ml新乌头碱作用K562细胞，S期的比例上升了4.40%，50μg/ml新乌头碱作用K562细胞，S期比例上升了17.88%。流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）分析白血病细胞株K562的CD34+CD38-等抗原变化。细胞分化抗原检测结果提示桂皮醛使K562细胞向髓系，红系分化，新乌头碱使K562细胞向巨核系分化，但同时能诱导K562中的干细胞比例降低。FCM通过Annexin V/PI染色法测定细胞凋亡变化，桂皮醛作用K562细胞72h后凋亡率明显增加，50μg/ml桂皮醛作用K562细胞72小时，细胞凋亡率为1.979%；75μg/ml桂皮醛作用K562细胞72小时，细胞凋亡率为5.690%。25μg/ml新乌头碱作用K562细胞72小时，细胞凋亡率为1.983%；50μg/ml新乌头碱作用K562细胞72小时，细胞凋亡率为6.172%。提示桂皮醛和新乌头碱可能部分通过诱导细胞凋亡的途径来抑制细胞增殖。甲基纤维素细胞体外克隆形成细胞培养法观察白血病细胞株K562集落形成情况，自我更新和增殖能力。桂皮醛和新乌头碱能够明显抑制K562细胞的克隆形成，50μg/ml 、75μg/ml桂皮醛组集落形成率分别为（1.25±0.13）%、（2.70±0.36）%，25μg/ml、50μg/ml新乌头碱组集落形成率分别为（1.72±0.18）%、（1.91±0.13）%，加药组与对照组相比有统计学意义（P<0.05）。